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Western blot parcialmente desnaturalizante de Transtirretina  
en plasmas de portadores de la mutación V30M  
ARTÍCULO ORIGINAL  
Western blot parcialmente desnaturalizante de  
Transtirretina en plasmas de portadores  
de la mutación V30M  
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Cardini, Juan ; Sáez, María Soledad ; Llanos, Macarena ; Sorroche, Patricia Beatriz ; Lorenzón, María Victoria ; Wilda, Maxi-  
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miliano ; Grigera, Pablo Rafael .  
1
Instituto Universitario y Laboratorio Central (IUHI, LCHI), Hospital Italiano, Buenos Aires, Argentina.  
CEVAN/ ICT Milstein-CONICET, Buenos Aires, Argentina.  
2
Dirección de correspondencia: prgrigera@conicet.gov.ar  
Resumen  
La transtirretina humana (TTR) es una proteína homotetramérica esencial para el transporte de ti-  
roxina y retinol en individuos sanos. Mutaciones puntuales, particularmente substituciones de valina  
por metionina en posición 30 (V30M), desestabilizan los complejos de TTR y dan lugar a la liberación  
de monómeros (14 Kd, TTRm), responsables de la creación de depósitos amiloideos en el intersticio  
de tejidos cardiacos y cerebrales. El análisis en Western inmunoblot de plasmas humanos desnatura-  
lizados por alta temperatura (95 C°, 10 minutos) en presencia del detergente iónico dodecyl sulfato de  
sodio (SDS) y utilizando anticuerpos monoclonales (Mabs) contra la molécula total o suero policlonal  
p71/98 dirigido contra la secuencia de aminoácidos 71 a 98 de TTR, detectan la presencia de TTRm,  
tanto en individuos positivos (portadores) como negativos para la mutación V30M. El suero policlonal  
p71/98 también identifica un polipéptido de 55-60 KD (TTRt) que corresponde a tetrámeros de TTR  
resistentes al tratamiento combinado de SDS y alta temperatura. El procesamiento de las muestras  
en presencia de SDS, pero a temperatura ambiente,(desnaturalización parcial) produce un notable  
incremento de TTRt y desaparición paralela de la banda correspondiente a TTRm en plasmas de indi-  
viduos normales, pero no en plasma de portadores V30M-positivos, en los que TTRm continúa siendo  
claramente detectable. Los resultados sugieren que una simple modificación en el procesamiento de  
las muestras plasmáticas puede convertir al Western inmunoblot en una herramienta de utilidad para  
el screening de plasmas de portadores de ésta y otras mutaciones desestabilizantes de la estructura  
multimérica de TTR en el laboratorio clínico.  
Palabras clave: amiloidea, transtirretina, Western inmunoblot, plasma humano, tetrámeros.  
Abstract  
Human transthyretin (TTR) is a homotetrameric protein essential for the transport of thyroxine and  
retinol in plasma of healthy individuals. Point mutations, mainly a substitution of valine to methionine  
at position 30 (V30M), result in disruption of TTR complexes and release of TTR monomers responsi-  
ble for building amyloid deposits in the interstice of heart and brain tissues. Denaturing immunoblot  
analysis of plasma samples, with either monoclonal antibodies (MAbs) raised against the whole TTR  
molecule or with monospecific serum directed to the C-terminal track containing amino acid residues  
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1 to 98 (p71/98), readily identified the 14 Kd monomeric form of TTR in both V30M mutant-carrier  
and in non-carrier individuals. P71/98 also identified a 55-60 Kd polypeptide (TTRt) corresponding  
to a fraction of TTR tetramers that either escape disruption by the combined use of SDS and heat  
treatment and/or refolded during the first stages of PAGE/SDS running. A milder treatment avoiding the  
heating of plasma samples prior to immunoblot resulted in a notable increase in TTRt and disappearan-  
ce of monomeric TTR in samples from V30M-negative individuals but not in those from V30M-positive  
carriers where free TTR monomers are systematically detected by p71/98 serum. Our results suggest  
that minimizing the TTR complex disruption before PAGE-SDS/ immunoblot analysis could be simple  
strategy to sort plasmas from V30M-positive and V30M-negative individuals in the clinical laboratory.  
Keywords: amyloid, transthyretin, Western immunoblot, human plasma, tetramers  
ISSN 1515-6761 Ed. Impresa  
ISSN 2250-5903 Ed. CD-ROM  
Código Bibliográfico: RByPC  
Fecha de recepción:  
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7/08/2018  
Fecha de aceptación:  
6/02/2019  
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ByPC 2018;82(2):22-27.  
Western blot parcialmente desnaturalizante de Transtirretina  
en plasmas de portadores de la mutación V30M  
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Introducción  
Figura 1.  
La polineuropatía amiloidótica familiar (FAP) es una en-  
fermedad autosómica dominante caracterizada por el depó-  
sito de material fibrilar formado por moléculas de TTR (TTR,  
14 Kd, transportador plasmático de tiroxina y retinol), que  
se acumulan en el espacio intersticial de nervios periféri-  
cos y tejido muscular cardíaco. Mutaciones de sustitución  
en la secuencia de TTR interfieren con su capacidad para  
asociarse en tetrámeros estables, dando por resultado un  
exceso relativo de monómeros libres, disponibles para la  
formación de depósitos amiloideos y el subsiguiente daño  
tisular (2,3,4). La más común, entre cientos de mutaciones  
puntuales ya descriptas, es la que codifica para la sustitu-  
ción Val30Met en el extremo N terminal de la secuencia TTR  
(5,6).  
Entre las principales contribuciones del laboratorio clí-  
nico al diagnóstico de la enfermedad amiloidótica se des-  
tacan la inmunohistoquímica (IHC) y la espectroscopía de  
masas (MS), en la identificación de TTR en biopsias; así  
como también la secuenciación del ADN genómico en san-  
gre periférica para detectar posibles portadores mutantes  
ꢀ
A) Secuencia completa de TTR (ácidos 1 a 127) expresada en célu-  
las BL21DE3. Se destacan en azul y rojo las secuencias de aminoá-  
cidos correspondientes a las proteínas recombinantes F127 y F74,  
respectivamente. B) Perfil de tinción con Ponceau Red de proteínas  
recombinantes, F127 y F74 que expresan la secuencia completa y  
(7,8,9,10,11). El Western blot desnaturalizante (SDS-PAGE  
seguido de inmunoblot) (12) también ha demostrado ser  
una herramienta analítica útil para detectar e identificar la  
TTR monomérica en plasma y material amiloideo (13,14).  
Sin embargo, esta técnica es inadecuada para diferenciar  
moléculas de TTR mutantes de las formas no mutadas, ya  
que en general no muestran diferencias en su comporta-  
miento migratorio ni inmunológico. Por lo tanto, se descri-  
be aquí una modificación simple en el protocolo de Western  
blot, con potencial para identificar plasmas de portadores  
de la mutaciónV30M y eventualmente otras también deses-  
tabilizantes de la estructura multimérica de TTR.  
71 aminoácidos C terminales de TTR (calles 2 y 3, respectivamente)  
y transferidos a nitrocelulosa después del análisis en 12% PAGE-SDS  
y antes de la incubación con anticuerpos apropiados. Las bandas  
de marcador en la calle 1 corresponden a pesos moleculares de 17,  
25, 35, 40, 55,70, 100 y 130 Kd, respectivamente. C) Reactividad  
de F127 y F74 con anticuerpos comerciales. Se mezclaron alícuotas  
equivalentes de lisados de bacterias que expresan independien-  
temente F171 y F74, se procesaron en PAGE / SDS, se transfirieron  
y se analizaron contra el suero p71 / 98 (calle 4) y los anticuerpos  
monoclonales MAbs #A, #B y #C (ver Mat y Métodos, en calles 5, 6 y  
7, respectivamente).  
Materiales y métodos  
Muestras de plasma: se obtuvieron plasmas de pacien- inicial) se cargaron en mini PAGE-SDS 12% y se transfirieron  
tes positivos o negativos para la mutación V30M según la a nitrocelulosa (80mA / 17 V, 12 hs), que se bloqueó con BSA  
secuenciación del genoma del exón 2 del gen de la TTR en el al 3% PBS seguido de incubación con anticuerpos primarios  
Laboratorio Central del Hospital Italiano de la Ciudad de Bue- conjugados correspondientes, y desarrollo de señal con qui-  
nos Aires, a partir de muestras de sangre entera con EDTA, y mioluminiscencia (Pierce-ECL) y registro de datos con GBox  
se almacenaron a -20ºC hasta su análisis.  
Análisis en SDS-PAGE e inmunotransferencia: el proce- gel más anchos (12 mm en lugar de los 5 mm normales)  
(Syngene-Sinoptics). Se usaron eventualmente peines de  
-
dimiento general para el análisis SDS-PAGE e inmunoblots para permitir la carga de mayores volúmenes de muestras  
en un formato mini Bio-Rad se describió anteriormente de plasma (ver Figura 3A).  
(
15). En un experimento típico, 10 µl de plasma de porta- • Clonación y expresión en bacterias BL21-DE3: los frag-  
dores V30M e individuos control (negativos para la muta-  
ción V30M) se mezclaron independientemente con 10 µl  
de buffer muestra 2X Laemmli (Tris 0,05 M pH: 6,5, SDS 6%,  
mercaptoetanol al 10%) seguido de la adición de 80 µl de 1X  
del mismo tampón. La mezcla de 100 µl se dividió luego en  
dos alícuotas idénticas que se calentaron a 95ºC durante  
mentos de ADN que codifican para la secuencia de la TTR  
completa de 127 aminoácidos o aminoácidos terminales  
74-C, se amplificaron mediante la técnica de la cadena de  
la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) usando  
un ADN sintético (IDT) que contiene la secuencia de co-  
dificación TTR (16) como templado. Los fragmentos am-  
plificados se clonaron en sitios Bam HI-Hind III del vector  
pET30a (Novagen-RifeSciences) y se expresaron como  
proteínas recombinantes F127 y F74 en bacterias BL21-  
DE3 tras la inducción con IPTG.  
10-15 minutos (muestra desnaturalizada, D) o se dejaron  
a temperatura ambiente (parcialmente desnaturalizadas,  
PD) hasta la carga del gel. Aproximadamente 20-25 µl de la  
muestra total (equivalente a 2-3 µl de la muestra de plasma  
ByPC 2018;82(2):22-27.  
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Western blot parcialmente desnaturalizante de Transtirretina  
en plasmas de portadores de la mutación V30M  
•
Anticuerpos: cuatro anticuerpos comerciales dirigidos ante 4 anticuerpos específicos anti TTR. El anticuerpo de  
contra la TTR humana, un anticuerpo policlonal de cone- conejo monoespecífico P71/98 producido contra un pép-  
jo y 3 MAbs de ratón, se ensayaron frente a fragmentos tido sintético que contiene los restos de aminoácidos 71  
recombinantes F127 y F74 en Western inmunoblot. Los a 98 de la secuencia de TTR, reaccionó con ambos recom-  
anticuerpos monoclonales se codificaron con letras en el binantes F127 y F74 (calle 4). Cada uno de los otros tres  
texto como: #A: MAb 7505 RyD, #B: clon MAb 10E1, Santa MAbs alternativos, generados contra TTR entera, mostra-  
Cruz y #C: Universidad Estatal de Iowa-MAb CPTC-TTR-1. ron reactividad con F127, pero no con F74, sugiriendo que  
Los tres MAbs se generaron contra la molécula de TTR su sitio de unión mapea en los primeros 53 aminoácidos  
completa utilizada como inmunógeno de acuerdo con N-terminales de TTR. Los resultados demuestran que el  
sus respectivos proveedores. El conejo policlonal p71 suero p71/98 es el anticuerpo de elección para la identifi-  
/
98 (PAS 35315, Thermo) se generó contra un péptido cación de fragmentos C terminales de TTR (8).  
sintético que contiene los residuos de ácidos 71 a 98 de  
la mitad C-terminal de TTR.  
Western blot de muestras de plasma post  
desnaturalización completa o parcial  
Resultados y discusión  
Reactividad de anticuerpos comerciales frente a TTR  
recombinante  
Se probó la reactividad del suero p71/98 y una mezcla de  
los tres MAbs anti TTR (MAb) contra 4 muestras de plasma de  
individuos V30M-negativos, obtenidos en el LCHI. La Figura 2A  
La Figura 1A representa 74 residuos de aminoácidos del muestra el perfil del polipéptidos totales teñido con rojo Pon-  
C-terminal y la secuencia completa de TTR (127 aminoáci- ceau correspondientes a las alícuotas de cuatro plasmas inde-  
dos) en azul y rojo, respectivamente. Ambas secuencias pendientes desnaturalizados (D) por calentamiento en buffer  
se expresaron en los polipéptidos recombinantes F74 y de Laemmli (95-98ºC 10 min), separadas en SDS-PAGE al 12%  
F127, respectivamente. Las respectivas secuencias de y transferidas a nitrocelulosa. Se detectan una banda mayo-  
ADN se clonaron en el plásmido de expresión pET30a bajo ritaria entre los marcadores de 55 y 70 Kd correspondiente a  
el promotor T7 y se expresaron en bacterias BL21DE3 tras seroalbúmina (SA) y una banda menor que corre más rápido  
la inducción con IPTG (véase Materiales y Métodos). La tin- que el marcador de 17 Kd e identificada como subunidad de  
ción de Ponceau en la Figura 1B muestra el perfil de ambos hemoglobina (H). Las Figuras 2B y 2C muestran el perfil de qui-  
recombinantes después de corrida por separado en PAGE/ mioluminiscencia después de incubaciones secuenciales con  
SDS y transferencia a membrana de nitrocelulosa (F127 y la mezcla MAb y con suero p71 / 98, respectivamente. Como se  
F74, calles 2 y 3, respectivamente). La Figura 1C muestra esperaba la mezcla de MAbs detectó una sola banda ligeramen-  
el perfil inmunorreactivo del par recombinante F127 y F74 te más rápida que el marcador de 17 Kd e identificada como el  
Figura 2.  
ꢀ
A) Perfil de tinción de Ponceau Red de muestras plasmáticas. Cuatro muestras de plasma de individuos V30M negativos se desnaturalizaron con  
calor (95-100 C°, 10 minutos) en buffer reductor de Laemmli, se analizaron en un mini gel SDS PAGE al 12%, se transfirieron a nitrocelulosa y se  
tiñeron (ver Mat y Métodos). La seroalbúmina (SA, 65 Kd) y la cadena de hemoglobina (H, 12 Kd) son componentes principales (calles 1 a 4).  
En la calle 5, una mezcla de lisados desnaturalizados de bacterias BL21-DE3 que expresan F127 y F71 después de la inducción con IPTG. Las  
puntas de flecha apuntan a los dos fragmentos expresados teñidos con reactivo Ponceau Red. B) Inmunorreactividad con MAbs anti TTR. Perfil  
de quimioluminiscencia obtenido después de la incubación de la membrana mostrada en A, con una mezcla equivalente de los tres MAbs anti-  
TTR #A #B, y #C (1: 200 cada uno, ver Mat y Métodos). TTRm: TTR monomérica y punta de flecha para el F127 detectado por la mezcla de MAbs  
en la calle 5. C) Inmunorreactividad contra suero de conejo p71 / 98. Perfil quimio luminiscente obtenido después de una segunda incubación  
seguida a la descripta en el punto B, con anticuerpo policlonal de conejo dirigido a la secuencia aminoacídica 71-98 en el C-terminal de TTR (ver  
Materiales y Métodos). Las puntas de flecha apuntan a F127 y F74, ambas reaccionan con pol 71/98. TTRt y TTRm son las formas tetraméricas  
y monoméricas de TTR, respectivamente.  
ByPC 2018;82(2):22-27.