Desarrollo de un sistema de cuantificación de frataxina humana para el diagnóstico complementario  
y seguimiento de individuos con Ataxia de Friedreich  
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ARTÍCULO ORIGINAL  
Desarrollo de un sistema de cuantificación de frataxina  
humana para el diagnóstico complementario y seguimiento  
de individuos con Ataxia de Friedreich  
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Varela, Carolina ; Pikielny, Ralph ; Balbi, Noelia ; Faraj, Santiago ; Santos, Javier ; Ferrari, Alejandro  
1Instituto de Química y Fisicoquímica Biológica (IQUIFIB), Conicet-UBA.  
2Departamento de Neurología, Fundación para la Lucha contra las Enfermedades Neurológicas de la Infancia (FLENI).  
Contacto: Dr. Alejandro Ferrari; Instituto de Química y Fisicoquímica Biológica (IQUIFIB), Conicet-UBA, Paraguay 2155 6to  
piso, C.A.B.A. (CP 1113); alejandro.ferrari@gmail.com  
Resumen  
Introducción: la Ataxia de Friedreich es una enfermedad genética de herencia autosómica recesiva,  
caracterizada por la dificultad en el movimiento. La causa es la mutación en el gen que codifica para una  
proteína mitocondrial denominada frataxina (Fxn), que participa del metabolismo del hierro y el ensam-  
blado de clústeres Fe-S. En todos los pacientes estudiados hasta el momento, hay niveles disminuidos  
de frataxina, o niveles normales de una proteína no funcional, y se sabe que el tipo de mutación genética  
condiciona la edad de debut clínico, el avance del cuadro clínico y los niveles de frataxina. Si bien no existe  
ningún tratamiento definitivo, hay consenso en que la terapéutica futura será la restitución de los valores  
fisiológicos de Fxn, mediante distintas estrategias moleculares. Objetivos: el objetivo de este trabajo fue  
desarrollar localmente un enzimoinmunoensayo para la cuantificación de Fxn en muestras biológicas, que  
sea de bajo costo y de relativa sencillez. Materiales y métodos: se produjeron la Fxn recombinante y anti-  
cuerpos policlonales específicos para dicha proteína, para desarrollar un EIA heterogéneo en fase sólida que  
permita distinguir individuos con FRDA de individuos sanos, y también de individuos con ataxia no-FRDA, con  
adecuada sensibilidad y especificidad. Resultados: el ensayo permitió distinguir las poblaciones de indivi-  
duos, estableciéndose como valor de corte 350 fg de Fxn por μg de proteína total. Conclusiones: el diseño  
del ensayo proporciona buena sensibilidad y especificidad (100 % y 95,7 %; respectivamente) y resulta útil  
para la determinación de Fxn en muestras de sangre.  
Palabras clave: ELISA, anticuerpos, detección, FRDA, AF.  
Abstract  
Introduction: Friedreich’s Ataxia (FRDA) is a recessive autosomic rare genetic disease, characterized by  
movement impairment. FRDA is caused by the mutation of the gene that codes for the mitochondrial pro-  
tein called frataxin (Fxn), which participates in iron metabolism and the assembly of Fe-S clusters. In all  
FRDA cases studied up to date, individuals have diminished Fxn levels or normal levels but with an impaired  
Fxn function. In addition, it is well known that the type of mutation determines the age of clinical onset, the  
progress of the clinical condition and the Fxn levels. Although there is no definitive treatment for individu-  
als with FRDA, there is an international consensus indicating that the main objective should be to restore  
the physiological values of Fxn, either by promoting mRNA transcription, reducing protein degradation or  
exogenously administering the protein. Objectives: The aim of this work was to develop a low-cost, simple  
analytical tool based on an enzyme-immunoassay (EIA) for the quantification of Fxn in biological samples.  
Materials and methods: Recombinant Fxn and specific polyclonal antibodies were produced to develop a  
heterogeneous EIA in solid phase, which allows the distinction of individuals with FRDA from individuals with  
non-FRDA related ataxias, and individuals without ataxia. Results. The assay had adequate sensitivity and  
specificity. It allowed the distinction of the different populations of individuals under study, establishing a  
cut-off value of 350 fg of Fxn per μg of total protein. Conclusions: The assay design has good sensitivity and  
specificity (100 % and 95.7 %; respectively) and is useful for Fxn determination in blood samples.  
Key words: ELISA, antibodies, detection, FRDA, FA.  
ISSN 1515-6761 Ed. Impresa  
ISSN 2250-5903 Ed. CD-ROM  
Código Bibliográfico: RByPC  
Fecha de recepción:  
/12/17  
Fecha de aceptación:  
1/1/18  
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ByPC 2018;82(2):11-21.  
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Desarrollo de un sistema de cuantificación de frataxina humana para el diagnóstico complementario  
y seguimiento de individuos con Ataxia de Friedreich  
Introducción  
Materiales y métodos  
La Ataxia de Friedreich (FRDA) es una enfermedad ge- Diseño experimental y población  
nética de herencia autosómica recesiva, que presenta un  
El diseño del ensayo fue de carácter prospectivo, trans-  
cuadro clínico que se caracteriza por la disartria, la ataxia de versal, observacional, con la finalidad de resolver el problema  
miembros superiores e inferiores, la escoliosis, el pie cavo, de la cuantificación de Fxn, en un sentido exploratorio. Este  
y las dificultades en la visión, la deglución y los trastornos proyecto fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad  
cardiovasculares [1-3]. La base molecular de la patología de Farmacia y Bioquímica, por Resolución 1475 (CUDAP: EXP-  
consiste en mutaciones en el gen fxn, el que codifica para FYB: 0744012/2012).  
la proteína frataxina (Fxn), que pueden ser de dos clases  
A los efectos de conducir las pruebas de validación de  
diferentes: por un lado, en un 95 % de los individuos que la metodología, se conformaron tres cohortes: una de in-  
padecen FRDA, ambos alelos del gen fxn poseen expansio- dividuos con FRDA, otra de individuos sin ataxia y otra con  
nes anómalas de un triplete GAA localizado en el primer in- individuos con ataxia no-FRDA. Las cohortes de individuos  
trón, que conduce a menores niveles de ARN mensajero y con ataxia (tanto FRDA como no-FRDA) se conformaron con  
Fxn madura [13]. En el 5 % restante de los individuos que pacientes voluntarios de la Fundación para la Lucha contra  
padecen FRDA, solo uno de los alelos del gen fxn posee una las Enfermedades Neurológicas de la Infancia (FLENI) y del  
expansión del triplete GAA, mientras que el otro posee una Hospital de Clínicas José de San Martín, que presentaban sin-  
de varias mutaciones puntuales posibles, constituyendo lo tomatología de ataxia. Para la inclusión en alguno de los dos  
que se conoce como un individuo heterocigota compuesto. grupos, se consideró como criterio la existencia de un aná-  
Esas mutaciones son variadas, están distribuidas a lo largo lisis genético que comprobara o descartara la presencia de  
de todo el gen fxn, y pueden conducir a un cambio del ami- FRDA. Los individuos sanos (sin ataxia) fueron reclutados de  
noácido codificado, a un corrimiento del marco de lectura o entre la comunidad, siempre y cuando no tuvieran sintoma-  
incluso a la producción de una proteína truncada por la apa- tología ni antecedentes familiares de ataxia. Todos los indivi-  
rición de un codón stop prematuro [13-17]. Aunque no es duos fueron debidamente informados de los propósitos del  
demasiado lo que se sabe, hay un vínculo claro entre el nivel proyecto, de sus alcances y limitaciones, y se les hizo firmar  
de expresión, la funcionalidad de Fxn y el fenotipo resultan- un documento de consentimiento informado. En el caso de  
te [18-21].  
ser menores, el consentimiento informado fue firmado por la  
No existe ningún tratamiento definitivo para los pacien- madre, padre o tutor. Los criterios de exclusión de los volun-  
tes con FRDA, salvo los cuidados paliativos. Independien- tarios fueron los mismos que se utilizan habitualmente para  
temente de esta clase de tratamientos, existen ciertos de- la selección de donantes de sangre total y componentes  
sarrollos en marcha cuya finalidad es restituir los valores sanguíneos en centros de salud, según el Ministerio de Salud  
fisiológicos de Fxn, enfocados a elevar los niveles de ARN de la República Argentina.  
mensajero, o a estabilizar los niveles existentes [22-29].  
Adicionalmente, hay quienes sugieren que podría restituirse Producción de Fxn recombinante  
el fenotipo sano aportando Fxn exógena, como es el caso de  
la iniciativa descripta por Vyas en 2012 [30].  
El plásmido conteniendo el gen de la proteína Fxn fue gen-  
tilmente cedido por la Dra. Helen Puccio. La expresión de la  
Aunque la utilidad ha sido descripta antes [31-32], en la proteína recombinante fue realizada en E. coli, tal como fue  
actualidad no existe ningún laboratorio en el país que realice descripto antes por este grupo de trabajo [8]. Brevemente,  
la determinación de Fxn en muestras biológicas. Asimismo, luego de la inducción de la síntesis de la proteína recombi-  
los kits comerciales para valoración de Fxn –todos ellos nante (rFxn, incluye los residuos 90 a 210 de Fxn), el cultivo  
de fabricación extranjera– no han sido validados con fines de bacterias fue centrifugado a 6.000 rpm durante 15 minu-  
clínicos. En este contexto, resulta fundamental contar con tos a 4 °C, y el pellet fue conservado a -20 °C. Para purificar la  
una metodología analítica cuantitativa que permita valorar proteína, el pellet fue resuspendido en buffer Tris-HCl 20 mM  
los niveles de Fxn para su uso en el ámbito clínico. Dicho de- pH 7,0, EDTA 1 mM. La lisis celular se logró mediante prensa  
sarrollo contribuiría al diagnóstico a modo de herramienta tipo francesa o sonicación. El lisado obtenido fue centrifuga-  
complementaria, y también serviría para dar seguimiento do a 16.000 rpm durante 15 minutos a 4 °C. La proteína rFxn  
tanto a los pacientes que ya reciben alguna clase de tra- fue purificada en dos pasos a partir de la fracción soluble: 1)  
tamiento, como a aquellos que reciban alguno de los trata- DEAE pH 7,0 eluyendo con gradiente de NaCl; 2) exclusión  
mientos venideros descriptos más arriba.  
molecular en G100. Cada partida de proteína fue sometida  
En este trabajo se desarrolló localmente un enzimoinmu- a un control de pureza e identidad por SDS-PAGE, exclusión  
noensayo (EIA) de bajo costo y de relativa sencillez para la molecular analítica acoplada a dispersión de luz (SEC-MALS-  
cuantificación de Fxn en muestras biológicas. Dicha meto- QELS) y HPLC/espectrometría de masa (HPLC/ESI-MS), y un  
dología fue luego puesta a prueba con una población de in- control conformacional por fluorescencia y dicroísmo cir-  
dividuos sanos, una población de individuos con FRDA y un cular (CD) en el UV cercano y lejano (estructura terciaria y  
grupo de individuos con ataxias no-FRDA.  
secundaria, respectivamente).  
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Producción de anticuerpos anti rFxn  
La preparación del suero hiperinmune contra rFxn en cone-  
Optimización del EIA  
Se optimizó un EIA de competencia en fase heterogénea.  
jos de la raza Nueva Zelanda, se realizó empleando rFxn pura de Este ensayo consiste en preincubar las muestras o estándares  
concentración conocida, en presencia de adyuvante (hidróxido de concentración de Fxn con una dilución conocida de anticuer-  
de aluminio 4 % p/v, hidróxido de magnesio 4 % p/v, en PBS). po anti-Fxn. La mezcla así obtenida se incuba luego en una mi-  
El título del antisuero se determinó por la técnica de ELISA, tal croplaca cuyos pocillos han sido recubiertos con Fxn, de modo  
como se describe en el párrafo siguiente.  
que los anticuerpos que no han sido bloqueados en la preincu-  
Para producir este suero, los conejos recibieron 6 dosis de bación, quedan pegados a la microplaca. Luego del lavado, los  
100 μg de proteína rFxn purificada, en adyuvante completo de anticuerpos unidos se detectan empleando anticuerpos anti-  
Freund, a razón de una dosis por semana. Al cabo de ese tiempo conejo unidos a peroxidasa (HRPO), y posterior revelado con  
se tomó a los animales una muestra de sangre por punción de solución de sustrato cromógeno (TMB), y detenido con H SO  
2
4
la arteria auricular. El suero se separó por centrifugación (10 4N (Figura 1). La optimización general del ensayo se realizó en  
minutos a 3.000 rpm) y fue conservado a -20 ºC hasta el mo- una serie de etapas, que se describen a continuación:  
mento de su uso. El título de anticuerpos específicos contra el  
inmunógeno se determinó por ELISA. Brevemente, se recubrie-  
ron los pocillos de una placa de 96 pocillos (Nunc MaxiSorp) con  
a) determinar la dilución óptima del anticuerpo de conejo-anti-  
rFxn previamente producido, realizando en una curva de calibra-  
ción con diferentes diluciones de anticuerpo primario y utilizando  
1xEC50, 2xEC50 y 4xEC50 (valores que surgen de la curva de  
titulación de anticuerpo primario); a su vez, esta comparación se  
realizó empleando micro placas sensibilizadas con 0,1 μg de rFxn  
por pocillo, y 1 μg de rFxn por pocillo; la curva de calibración se rea-  
lizó desde 0,3 μg/ml en adelante, empleando diluciones 1/2, y la  
dilución de anticuerpo conjugado fue en exceso (1 / 5.000);  
b) determinar la masa óptima de rFxn inmovilizada en la micro-  
placa; utilizando el mismo diseño mencionado en el punto ante-  
rior, se evaluó el rendimiento del sistema empleando 0,1 μg de  
rFxn por pocillo, y 1 μg de rFxn por pocillo.  
0,5 μg/pocillo de rFxn durante 1 hora a 37 ºC, luego se lavó con  
PBS-Tween 20 0,05 % v/v y finalmente se procedió al bloqueo  
durante 18 hs (O.N.) a 4 ºC con PBS + leche en polvo 3 % p/v. La  
placa se lavó de igual modo, y los sueros de conejo se incuba-  
ron en diluciones seriadas al cuarto, partiendo desde 1/1.600.  
La presencia de anticuerpos específicos se reveló empleando  
un anticuerpo conjugado (HRPO) comercial (Bethyl) en dilu-  
ción 1/5.000, incubado en la placa durante 1 h a 37 ºC en un vo-  
lumen final de 100 μl de diluyente (el mismo que el bloquean-  
te). El revelado colorimétrico se realizó empleando un sustrato  
cromogénico comercial (TMB, Life Technologies) durante por lo  
menos 10 minutos, y deteniendo la reacción por agregado de  
c) definir cuál es el mejor buffer de dilución de muestras y están-  
dares de concentración; en esta fase del trabajo se comparó el  
rendimiento del diluyente formulado a base de PBS-leche en pol-  
vo al 3 % (p/v), respecto de PBS-SFB al 10 % (v/v).  
5
0 μl de H SO 4 N. La lectura de densidad óptica se realizó en  
2 4  
un lector de microplacas (TECAN Instruments) y el análisis de  
las curvas se realizó utilizando el software Graph Pad Prism 6.0.  
d) evaluar las condiciones de conservación del anticuerpo prima-  
rio; para ello, se comparó el decaimiento de la curva de titulación  
de alícuotas congeladas y descongeladas varias veces a lo largo  
de un intervalo de tiempo (hasta 5 meses), con el resultado de  
mantener una alícuota a 4 ºC en presencia de 50 % de glicerol y  
azida sódica 0,02 % (p/v).  
Figura 1. Esquema del diseño del ELISA de competencia en  
fase heterogénea.  
e) evaluar qué calidad de microplacas resultan más apropiadas,  
en relación con la sensibilidad del método y los niveles de anali-  
to en muestras de individuos sanos. En esta fase del trabajo, se  
compararon placas Nunca Maxisorp de alto pegado, con placas  
Nunca Polisorp de pegado estándar.  
f) estudiar la estabilidad de la Fxn en muestras de sangre anticoa-  
gulada mantenida a 4 ºC; para ello, se realizó la determinación de  
Fxn, tal cual fue optimizada en etapas anteriores, sobre muestras  
de sangre entera sin procesar, conservadas entre 5 y 0 días a 4 ºC.  
Esta determinación se realizó sobre muestras de donantes sa-  
nos, apareando el muestreo de modo que ninguna persona deba  
someterse a la extracción de sangre más de dos veces durante el  
ensayo.  
g) determinar la reproducibilidad del ensayo; finalmente, la curva  
de Fxn fue realizada 3 veces en días distintos, por el mismo ope-  
rador, con la finalidad de estudiar el coeficiente de variación sobre  
la medición de Fxn. Se analizó el coeficiente de variación de los  
parámetros de ajuste (asíntota superior, asíntota inferior, punto  
medio –denominado EC50– y pendiente del punto medio).  
ꢀ
Se observa la secuencia de pasos para la detección de Fxn. Paso 1ºA,  
preincubación del anticuerpo anti-rFxn con la muestra, o batería se-  
riada de estándares de rFxn de concentración conocida; panel 1ºB,  
recubrimiento de los pocillos de la microplaca de ELISA con rFxn, y  
posterior bloqueo de sitios inespecíficos; panel 2º, incubación de la  
mezcla de anticuerpos y estándares/muestra en los pocillos de la  
microplaca. Panel 3º, detección de anticuerpos unidos, utilizando un  
conjugado anti-conejo, marcado con HRP. Panel 4º, aspecto general  
de las curvas sigmoideas de calibración obtenidas.  
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Optimización de la obtención de muestras  
Producción de Fxn recombinante  
La extracción de las muestras biológicas de sangre pe-  
La preparación de rFxn fue realizada conforme lo indicado  
riférica se realizó por venopunción. Para la puesta a punto, en la sección de Materiales y Métodos. Como resultado, se  
se extrajeron muestras de sangre de 3 dadores sanos (de obtuvo una proteína de aproximadamente 13 kDa, estable y  
6
a 10 ml de sangre por donante, en tubos con EDTA). So- con alto grado de pureza electroforética, tal como se obser-  
bre esas muestras se analizaron los resultados de diferen- va en la Figura 2. La proteína mostró un grado de pureza su-  
tes tratamientos de la muestra; entre ellos, se comparó el perior al 98 %, y una concentración de alrededor de 1,2 mg/  
lisado de sangre entera utilizando 1 % NP 40, 10 % glicerol, ml. La proteína fue fraccionada y mantenida a -20º C hasta el  
EDTA 1 mM, PMSF 1 mM (partes iguales de sangre y buffer momento de su uso. La masa teórica de la proteína purifica-  
de lisis), con la medición de proteína en el plasma obteni- da y obtenida experimentalmente por ESI-ES coincide per-  
do por centrifugación (10 minutos a 3.000 rpm). de sangre fectamente (13605,15 y 13604,92 Da, respectivamente)  
anticoagulada con EDTA, y en el paquete total de células indicando la ausencia de modificaciones postraduccionales  
obtenido por ese mismo proceso de centrifugación. La con- o proteólisis. El espectro de CD en el UV cercano obtenido  
centración proteica total de las muestras biológicas se de- es compatible con el esperado para esta variante de Fxn, en  
terminó mediante la técnica del ácido bicinconínico (BCA), su conformación nativa y superponible con los espectros  
y los resultados de las mediciones de Fxn se relativizaron al publicados previamente [33]. Es importante notar que las  
contenido total de proteínas extraídas.  
señales de CD en este rango del espectro UV provienen de  
la existencia de residuos aromáticos de Phe, Tyr y Trp en en-  
Determinación de Fxn en la cohorte de voluntarios reclutados tornos asimétricos, resultado de la rigidez de la estructura  
Para el estudio del rendimiento del ensayo diseñado con terciaria de la proteína. El espectro de CD en el UV cercano  
individuos con ataxia (FRDA y n-FRDA), se siguieron los li- puede considerarse como una “huella digital” del estado  
neamientos descriptos antes. Todas las muestras fueron conformacional de la proteína purificada.  
conservadas durante no más de 3 horas a 4 ºC hasta su pro-  
cesamiento.  
Producción de anticuerpos anti rFxn  
La identidad de todos los pacientes quedó protegida por  
Conforme a lo descripto, los conejos recibieron 6 dosis de  
una codificación dependiente de una clave hexadecimal 100 μg de proteína rFxn purificada, en adyuvante comple-  
compuesta por las primeras dos letras del nombre, seguidas to de Freund, a razón de una dosis por semana. Al cabo de  
de las dos primeras letras del apellido, y los cuatro dígitos ese tiempo se obtuvieron muestras por punción de la arte-  
del año de nacimiento. La base de datos con los nombres de ria auricular, y la sangre así obtenida fue dejada coagular.  
los pacientes quedó bajo el resguardo de los responsables El suero se separó por centrifugación y se tituló por ELISA.  
del proyecto en un archivo codificado con clave de seguri- Los resultados de esa titulación se observan en la figura 3 A  
dad.  
(conejo #1) y B (conejo #2), donde se aprecian las curvas  
Los datos fueron almacenados en una planilla de cálcu- de titulación de cuatro sangrías exploratorias (S1 a S4) y de  
lo, una para la codificación de los individuos estudiados, y la sangría final (SF).  
otra con los resultados. El tratamiento estadístico de los  
En las figuras 3 C y D se observan los valores del paráme-  
datos se realizó verificando primero la homogeneidad de las tro EC50, utilizado aquí como indicador del título (en ausen-  
varianzas con el test de Brown-Forsythe, y –considerando  
que los resultados mostraron diferencias grandes en las va-  
rianzas de los datos– luego con un test de Kruskal-Wallis  
combinado con una comparación, a posteriori, en la que se  
uso el test de Dunn. Estos cálculos fueron realizados con el  
software Graph Pad Prism 6.0.  
Figura 2. Resultado de la purificación de la proteína Fxn re-  
combinante.  
Resultados  
Diseño experimental y población  
Durante el transcurso de este proyecto, se conformaron  
tres cohortes: (1) individuos con FRDA, (2) individuos sa-  
nos e (3) individuos con ataxias no-FRDA. Estas cohortes  
quedaron conformadas por 21, 15 y 8 individuos, respecti-  
vamente.  
Entre los pacientes con ataxias no-FRDA hubo 5 casos de  
ꢀ
La figura muestra el resultado de la purificación de rFxn. En el panel  
A se observan las bandas correspondientes a las sucesivas elucio-  
nes de la proteína purificada (calles 1 a 5); a la izquierda se consigna  
el valor aproximado del peso molecular (13 kDa). En el panel B se  
muestra un espectro de CD en el UV cercano de la proteína purificada.  
Ataxia Espinocerebelosa (SCA), un caso de Atrofia Muscular,  
un caso de ataxia por gluten y un caso de paraparesia es-  
pástica. La Tabla I resume las características principales de  
los voluntarios reclutados.  
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Tabla I. Resumen de las características de los reclutados.  
#
Paciente  
DAOJ1979  
LERO1986  
ROMA1968  
NONA1962  
AGMO1996  
LADV2001  
ANDV1989  
NIBA1986  
GIBA1990  
DIDE1972  
ANDE1976  
NIRA1970  
MAGO1995  
JALA1996  
VIBE1986  
GLBE1966  
JOBE1963  
ABCH1970  
ALCH1966  
JUOL1951  
FRIP2002  
SOHI1989  
NAFA1988  
AIDI1990  
Signos  
AT, ES  
AT, ES  
AT, CA, ES  
AT, CA, ES  
AT  
Mutación  
Institución  
FLENI  
Condición  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
FRDA  
Sano  
Sano  
Sano  
Sano  
Sano  
Sano  
Sano  
Sano  
Sano  
Sano  
Sano  
Sano  
Sano  
Sano  
Sano  
AM  
Fxn (pg/µg)  
0
1
Expansión  
2
3
4
5
6
7
8
9
Expansión  
FLENI  
0
Expansión  
FLENI  
0
Expansión  
FLENI  
299  
0
Expansión  
FLENI  
AT  
Expansión  
FLENI  
32  
AT  
Expansión  
FLENI  
0
AT  
Expansión  
FLENI  
0
AT  
Expansión  
FLENI  
0
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
1
2
3
4
AT  
Expansión  
Htal. Clínicas  
Htal. Clínicas  
Htal. Clínicas  
Htal. Clínicas  
Htal. Clínicas  
FLENI  
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
AT  
Expansión  
11  
AT  
Expansión  
0
AT  
Expansión  
104  
4
AT  
Expansión  
AT  
Expansión  
0
AT  
Expansión  
FLENI  
0
AT  
Expansión  
FLENI  
0
AT  
Expansión  
FLENI  
0
AT  
Expansión  
FLENI  
0
AT  
Expansión  
FLENI  
0
AT  
Expansión  
FLENI  
0
---  
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---  
---  
654  
666  
671  
781  
376  
655  
1031  
1024  
697  
1071  
1149  
533  
798  
707  
1491  
773  
437  
379  
2857  
673  
171  
923  
441  
---  
---  
---  
---  
DAGO1978  
ADFR1990  
ALFE1980  
ELCE1988  
MAMO1988  
MALE1988  
MAPA1979  
MACA1976  
JASA1974  
ERRO1979  
SAFA1988  
LUDE1988  
ESMO1984  
JUSA1981  
MIAR1969  
RUDA1963  
NETO1961  
FRVE1981  
MIES1976  
JOSO1970  
---  
---  
---  
---  
---  
---  
---  
---  
---  
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---  
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---  
---  
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---  
---  
---  
AM  
AT  
Htal. Clínicas  
Htal. Clínicas  
Htal. Clínicas  
Htal. Clínicas  
Htal. Clínicas  
Htal. Clínicas  
Htal. Clínicas  
Htal. Clínicas  
SCA  
AT  
AG  
AT  
PE  
AT  
SCA  
AT  
SCA  
AT  
SCA  
AT  
SCA  
ꢀLa columna de “signos” se refiere a los signos clínicos más relevantes, como son: ataxia (AT), atrofia muscular (AM), escoliosis (ES) y cardiopatía  
(CA). La columna “condición” se refiere a la etiología de la patología, e incluye individuos con ataxia de Friedreich (FRDA), con atrofia muscular  
(AM), ataxia por gluten (AG), paraparesia espástica (PE) y ataxia espinocerebelosa (SCA).  
ByPC 2018;82(2):11-21.  
16  
Desarrollo de un sistema de cuantificación de frataxina humana para el diagnóstico complementario  
y seguimiento de individuos con Ataxia de Friedreich  
Figura 3. Curvas de titulación de sueros de conejo anti rFxn.  
A
B
C
D
ꢀ
La figura muestra el resultado de la titulación de los sueros de conejos hiperinmunes contra rFxn (panel A, conejo #1; panel B, conejo #2). Se  
observa que salvo la primera sangría del conejo #1, todas las fracciones de suero colectadas presentan un título que está por encima de 10.000,  
utilizando el parámetro EC50 (punto de inflexión de la curva sigmoidea de 4P), como indicador relativo del título. En los paneles C y D se muestra  
el valor del título (EC50) obtenido a partir de las curvas de titulación de la figura anterior. Se observa que el suero correspondiente al conejo #1  
presentó valores superiores en todos los tiempos de sangría, salvo en la primera.  
cia de un valor de corte). Esas figuras muestran que el título (vale recordar que los sueros que conforman la mezcla de-  
obtenido para los sueros correspondientes a ambos cone- finitiva no fueron mezclados en volúmenes iguales, y que  
jos no fue equivalente. El suero así obtenido fue fraccionado el título final predominante es el del conejo #1, por ser las  
y conservado a -20 °C hasta su uso. Alícuotas de uso se con- fracciones de volumen preponderante).  
servaron a 4-8°C en azida sódica y 50% v/v de glicerol.  
Para la selección final de la dilución de anticuerpo que se  
usará en el ensayo definitivo, se realizó un ensayo de com-  
petencia (tal como fue relatado con anterioridad), en el que  
Optimización del EIA  
Una vez obtenida la fuente de anticuerpos específicos se emplearon dos concentraciones de rFxn (0,1 μg/pocillo  
para rFxn (suero de conejo hiperinmune) se procedió a op- y 1 μg/pocillo) unida a la placa, y tres diluciones distintas  
timizar un protocolo de competencia con preincubación en de suero conejo-anti-rFxn (1xEC50, 2xEC50 y 4xEC50), va-  
fase heterogénea. Esta estrategia demostró ser sencilla y lorando una serie de concentraciones de rFxn estándar so-  
relativamente económica, por requerir un único anticuerpo luble desde 150 ng/ml en adelante. Los resultados se mues-  
específico no comercial.  
tran en las figuras 4 A y B.  
A continuación, se describen los principales hallazgos  
En ambos paneles se observa una relación lógica entre  
durante la puesta a punto de la metodología, tal como se co- las diferentes diluciones de anticuerpo primario (a mayor  
mentó en la sección de materiales y métodos. concentración del anticuerpo, mayor señal), así como una  
a. Dilución óptima del anticuerpo anti-rFxn producido en forma lógica para un ensayo competitivo (a mayor concen-  
conejo.  
tración de analito en fase líquida, menor señal final). En am-  
Considerando los datos bibliográficos y la propia expe- bos gráficos se observa que la dilución 1xEC50 provoca una  
riencia, se eligió una dilución inicial de uso del anticuerpo señal máxima cercana a abs = 1 a 450 nm, algo que resulta  
primario que coincidía con el punto de inflexión de la curva óptimo en términos de la linealidad de la relación entre la  
sigmoidea de 4 parámetros, valor al que se denomina EC50 señal y la concentración de analito, en términos de la Ley  
(
interacción del anti-rFxn con fase sólida). de Lambert y Beer. Por ese motivo, se decidió trabajar con  
A partir del análisis de las curvas de titulación que apa- 1xEC50.  
recen en la figuras 2, se determinó ese valor en 1 / 40.000 b. Masa de rFxn inmovilizada en la microplaca  
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Desarrollo de un sistema de cuantificación de frataxina humana para el diagnóstico complementario  
y seguimiento de individuos con Ataxia de Friedreich  
17  
Figura 4. Puesta a punto de la dilución de anticuerpo primario.  
ꢀCalibración de la dilución de anticuerpo primario en el ensayo competitivo. Se observan dos cantidades de antígeno sensibilizante, y tres dilucio-  
nes posibles para el anticuerpo primario. La dilución del anticuerpo conjugado fue siempre la misma (1/5.000).  
En relación con la masa de rFxn inmovilizada en la micro- ta máxima y la mínima es considerablemente mayor en el  
placa, las propias Figuras 4 A y B muestran que el incremen- caso del diluyente formulado a base de PBS + SFB 10 % v/v.  
to en 10 veces la masa de rFxn provoca un aumento propor- Por ese motivo, se seleccionó ese diluyente para todos los  
cional de la señal inferior a lo esperado. En ese contexto, y ensayos posteriores.  
bajo la premisa bibliográfica de que en los ensayos compe-  
d. Condiciones de conservación del anticuerpo primario  
titivos la interacción del anticuerpo con el antígeno en fase  
Considerando la periodicidad con la que el ensayo se iba  
sólida puede estar privilegiada con respecto a la interacción a realizar (esporádicamente), se decidió evaluar el efecto  
en fase líquida, se decidió trabajar con la mínima concen- del uso de una misma fracción de anticuerpos, congelándo-  
tración de rFxn, suficiente para proporcionar una señal final la y descongelándola cada vez. En la figura 6 se observa cla-  
significativa (0,1 μg/pocillo).  
ramente una disminución de la señal máxima del título con  
c. Buffer de dilución de muestras y estándares de con- los ciclos de congelado/descongelado, poniendo en eviden-  
centración  
De acuerdo con la experiencia previa y con la bibliografía  
cia la necesidad de implementar medidas de preservación.  
Además, se realizó un experimento control en el que se  
referida al tema, se identificaron dos diluyentes posibles estudió el efecto de mantener una alícuota durante el mis-  
para el ensayo, cuya misión es disminuir las interacciones mo período de tiempo que en el ensayo anterior, (35 días) a  
inespecíficas proteína-proteína y, en consecuencia, mini- -20 ºC o a 4 ºC en presencia de glicerol y azida sódica. Esta  
mizar el ruido analítico. Utilizando una dilución de 1xEC50 última formulación permite evitar los ciclos de congelado y  
y 0,1 μg/pocillo de rFXN, se comparó el resultado de diluir descongelado que, como es sabido, deterioran la actividad  
los anticuerpos y muestras en PBS + leche descremada en del anticuerpo, mientras que la primera permite tener un  
polvo al 3 % p/v, con respecto a PBS + 10 % v/v Suero Fetal control de la actividad del anticuerpo congelado. Los resul-  
Bovino. Los resultados se muestran en la figura 5.  
tados se observan en la figura 7, y muestran que una alícuo-  
El análisis de la figura muestra que, aunque la forma ta conservada en presencia de azida sódica y glicerol, retie-  
de las curvas es equivalente, la diferencia entre la asínto- ne prácticamente la misma actividad de anticuerpo que la  
Figura 5. Comparación de diluyentes de anticuerpos y muestras.  
ꢀEn la figura se observan las curvas de titulación del mismo suero hiperinmune, contra el mismo antígeno en la misma concentración; la única  
diferencia fue la composición del buffer diluyente.  
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18  
Desarrollo de un sistema de cuantificación de frataxina humana para el diagnóstico complementario  
y seguimiento de individuos con Ataxia de Friedreich  
Figura 6. Estabilidad del anticuerpo primario.  
Figura 7. Comparación de estrategias de conservación del  
anticuerpo primario.  
ꢀEl gráfico muestra el decaimiento en la actividad de anticuerpo 3 ꢀEn la Figura se observan las curvas de titulación en las condiciones  
(
29 - 3 - 2012) y 5 (12 - 4 - 2012) semanas después de la titulación  
experimentales elegidas, para una alícuota mantenida en glicerol y  
temperatura ambiente, y otra alícuota mantenida a -20 ºC sin des-  
congelar.  
inicial (7 – 3 - 2012). Estas alícuotas fueron descongeladas 1, 2 y 3  
veces respectivamente.  
alícuota control conservada a -20 ºC.  
porcentual de Fxn, y todos los datos fueron combinados en  
e. Calidad de microplacas  
un único gráfico, que es el que se muestra en la figura 9. En  
Finalmente, en términos de la puesta a punto del ensayo, dicha figura se observa que en 3 días se produce un descen-  
se comparó el resultado de utilizar placas de alta capacidad so de un 20 % en la concentración de Fxn, lo que implica un  
de unión (Nunc MaxiSorp certificadas) con placas de capa- descenso del 6,7 % diario.  
cidad baja (Nunc PoliSorp, sin certificar). Los resultados  
f. Determinación del coeficiente de variación de la medi-  
de esta experiencia se observan en la figura 8, y muestran ción entre ensayos.  
que efectivamente el rendimiento del ensayo es considera-  
Luego de optimizar las condiciones de ensayo, se realiza-  
blemente mejor en las placas de alta unión. Considerando ron tres experimentos (curvas de calibración) de modo in-  
el uso de la determinación, se decidió optar por las placas dependiente, en días diferentes, por el mismo operador. En  
MaxiSorp certificadas.  
cada experimento, se valoró también una muestra normal  
Se convocaron 10 donantes de sangre voluntarios, a de un donante voluntario. El resultado de analizar la misma  
quienes se les tomó una muestra el día del ensayo (día 0), muestra en los tres experimentos arrojó un coeficiente de  
y una muestra entre 5 y 1 días antes del ensayo (5 grupos variación porcentual del 19 %.  
de dos individuos cada uno). Cada una de las muestras fue  
mantenida a 4 ºC hasta el día 0, momento en el que fueron Puesta a punto de obtención y procesamiento de las muestras  
procesadas para la extracción de proteínas, y sometidas a  
Tal como se describió en el apartado de materiales y mé-  
la determinación de proteínas totales y de Fxn. Los resul- todos, considerando los parámetros optimizados (masa  
tados fueron expresados en términos de la recuperación de proteína recombinante recubriendo la placa, dilución de  
Figura 8. Comparación del rendimiento en función de la  
Figura 9. Recuperación porcentual de Fxn en función de la  
calidad de las microplacas.  
conservación de la muestra a 4ºC.  
e los  
días ulada  
a 4ºde la  
obtención (día 0, 100% de señal).  
ꢀEn la figura se observan las curvas de titulación correspondientes a  
dos categorías de microplacas de una misma marca (Nunc).  
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19  
Figura 10. Comparación de la recuperación de Fxn en  
muestras normales.  
Figura 11. Determinación de Fxn en muestras de individu-  
os sanos, FRDA y con ataxia no-FRDA.  
ꢀ
Valores de Fxn expresados en relación con el contenido total de pro-  
teínas de la muestra, para tres tipos de tratamiento de la muestra.  
En la figura se observa un gráfico de cajas y bigotes, aunque debe  
destacarse que en esta fase de optimización los datos por grupo son  
ꢀ
Valores de Fxn expresados en forma relativa a la masa total de pro-  
teínas de la muestra (sangre entera lisada), para los tres grupos de  
individuos. Se realizó una prueba de Kruskal-Wallis (no paramétrica)  
sobre los datos, y un test de Dunn a posteriori. Las letras indican las  
diferencias significativas, utilizando un test de Tukey con α = 0,05.  
3
(tres). Se observa el resultado obtenido con plasma, paquete glo-  
bular (PG) y sangre entera.  
anticuerpo primario, calidad de microplacas y diluyente), ataxia no-FRDA).  
se procedió a realizar la medición de Fxn en 3 muestras Discusión  
de donantes sanos, sin ataxia ni antecedentes familiares,  
En términos de la proteína rFxn, los resultados muestran  
conforme lo relatado en el apartado de conformación de los que se logró producir con alta pureza y en un excelente nivel  
grupos de individuos reclutados. Las muestras fueron obte- de expresión. Vale la pena mencionar que la variante de lon-  
nidas como se indicó previamente, y se separaron en tres gitud completa rFxn1-210 se expresa con niveles muy por  
fracciones: sangre entera, plasma anticoagulado, y paquete debajo con respecto a la variante elegida para este trabajo.  
celular obtenido por centrifugación. En la figura 10 se obser- Sumado a eso, la versión de longitud completa es mucho  
va el resultado, que indica que no hay Fxn libre en plasma, más propensa a agregar que la versión 90 - 210, por lo que  
y que la utilización del paquete globular aumenta levemen- claramente la rFxn empleada en este trabajo posee carac-  
te los valores obtenidos. Esta diferencia posiblemente sea terísticas que la vuelven sustancialmente superior que la  
como consecuencia de la eliminación de las proteínas del primera. Los estudios biofísicos confirmaron la identidad y  
plasma, que no aportan Fxn pero influyen en la expresión de cualidades óptimas para ser utilizada como inmunógeno y  
resultados (incrementando el valor del divisor), a expensas como estándar de concentración. Estos estudios biofísicos  
de la coherencia de los datos (aumenta la dispersión de los fueron establecidos como los controles rutinarios a ser rea-  
valores). En consecuencia, se decidió que toda muestra re- lizados sobre cada nuevo lote de rFxn producido, a modo de  
cibida sería procesada “en fresco”, realizando la extracción control de calidad.  
de proteínas de sangre total mediante el uso del buffer de  
La inmunización de conejos con dicho estándar en pre-  
lisis antes descripto, y las fracciones así obtenidas serían sencia del adyuvante proporcionó una buena respuesta  
conservadas en nitrógeno líquido hasta su uso.  
inmunológica, tal como lo revelan las curvas de titulación  
de los sueros por ELISA. Dichos títulos fueron cruciales para  
Determinación de Fxn en la cohorte de individuos reclutados conseguir alta sensibilidad en el método.  
Para validar la metodología en términos analíticos, se  
En relación con el proceso de optimización, y como resul-  
realizó la medición en la cohorte de pacientes reclutados, tado de los diferentes ensayos realizados, se concluyó que  
utilizando la metodología optimizada en las etapas ante- las microplacas deben ser de alto pegado, que la sensibiliza-  
riores. Todas las muestras fueron procesadas en un único ción debe realizarse con 0,1 μg de rFxn por pocillo, la dilución  
ensayo, y los resultados se resumen en la figura 9. Estos del anticuerpo primario debe ser 1xEC50, el diluyente debe  
muestran una disminución clara en la concentración de Fxn, ser PBS-SFB 10 %, y la conservación del anticuerpo puede rea-  
detectada en muestras de sangre entera de individuos con lizarse a 4 ºC en presencia de glicerol 50 % y azida sódica 0,02  
FRDA, con respecto a la concentración en muestras de in- % p/v. Asimismo, durante esa puesta a punto se concluyó que  
dividuos de ambos grupos control (sanos y pacientes con la muestra de sangre entera es apta para su procesamiento.  
ByPC 2018;82(2):11-21.  
20  
Desarrollo de un sistema de cuantificación de frataxina humana para el diagnóstico complementario  
y seguimiento de individuos con Ataxia de Friedreich  
Chem Commun (Camb) 2010;46:719-721.  
Tabla II. Resultados de la determinación de FRDA por ELISA  
y test genético.  
7.  
Roman EA, Faraj SE, Cousido-Siah A, Mitschler A, Podjarny  
A, Santos J. Frataxin from Psychromonas ingrahamii as a  
model to study stability modulation within the CyaY pro-  
tein family. Biochim Biophys Acta 2013;1834:1168-80.  
Test genético  
FRDA  
21  
no-FRDA  
8. Roman EA, Faraj SE, Gallo M, Salvay AG, Ferreiro DU, San-  
tos J. Protein stability and dynamics modulation: the  
case of human frataxin. PLoS One 2012;7:e45743.  
ELISA  
FRDA  
1
9
.
Stemmler TL, Lesuisse E, Pain D, Dancis A. Frataxin  
and mitochondrial FeS cluster biogenesis. J Biol Chem  
no-FRDA  
0
22  
ꢀ
La tabla resume los resultados mostrados en la Figura 11, identifi-  
cando verdaderos y falsos positivos del método de ELISA, así como  
verdaderos y falsos negativos de ese método.  
2010;285:26737-26743.  
1
0. Tsai CL, Barondeau DP. Human frataxin is an allosteric  
switch that activates the Fe-S cluster biosynthetic com-  
plex. Biochemistry 2010 49:9132-9139.  
Finalmente, en términos de los grupos de individuos, se  
observó que todos los pacientes con FRDA diagnosticada 11. Ye H, Rouault TA. Human iron-sulfur cluster assembly,  
poseen cantidades de Fxn menores a 350 fg Fxn por μg de  
proteína total (350 fg/μg). En contraposición, se comprobó  
cellular iron homeostasis, and disease. Biochemistry  
2010;49:4945-4956.  
que todos los individuos sanos tuvieron valores superiores 12. Yoon T, Cowan JA. Frataxin-mediated iron delivery to fer-  
a esta cifra, y que solo uno de los 10 individuos con ataxias  
no-FRDA tuvo valores menores a esa cifra. La Tabla II mues-  
rochelatase in the final step of heme biosynthesis. J Biol  
Chem 2004;279:25943-25946.  
tra el agrupamiento de datos para el cálculo de la sensibili- 13. Pandolfo M. The molecular basis of Friedreich ataxia.  
dad y especificidad analíticas.  
Neurologia 2000;15:325-329.  
De acuerdo con esta Tabla, la sensibilidad del método 14. Pandolfo M. Frataxin deficiency and mitochondrial dys-  
desarrollado, en relación con la identificación de pacientes  
function. Mitochondrion 2002;2:87-93.  
con FRDA, es del 100 %, mientras que la especificidad es 15. Pandolfo M. Iron and Friedreich ataxia. J Neural Transm  
95,7 %, pues uno de los 10 individuos con ataxia no-FRDA  
Suppl 2006;70:143-146.  
quedó clasificado como un falso positivo por ELISA.  
En conclusión, el método desarrollado es útil para la me-  
dición de Fxn en muestras de sangre periférica, y puede ser  
16. Pandolfo M, Pastore A. The pathogenesis of Friedreich  
ataxia and the structure and function of frataxin. J Neurol  
2009;256(Suppl 1) 9-17.  
utilizado como prueba complementaria en el diagnóstico, o 17. Saccà F, Marsili A, Puorro G, Antenora A, Pane C, Tessa  
herramienta de seguimiento. No obstante, el método diag-  
nóstico de referencia es la prueba genética, y el método  
aquí descripto no resulta concluyente por sí solo.  
A, et al. Clinical use of frataxin measurement in a pa-  
tient with a novel deletion in the FXN gene. J Neurol  
2012;260:1116-21.  
1
8. Patel PI, Isaya G. Friedreich ataxia: from GAA triplet-re-  
peat expansion to frataxin deficiency, Am J Hum Genet  
2001 69:15-24.  
Conflicto de intereses:  
Financiamiento: este trabajo fue parcialmente financia-  
do con fondos UBACYT-PDE 2015.  
19. Soragni E, Herman D, Dent SY, Gottesfeld JM, Wells RD,  
Napierala M. Long intronic GAA*TTC repeats induce epi-  
genetic changes and reporter gene silencing in a mo-  
lecular model of Friedreich ataxia, Nucleic Acids Res  
2008;36:6056-6065.  
20. Baralle M, Pastor T, Bussani E, Pagani F. Influence of  
Friedreich ataxia GAA noncoding repeat expansions on  
pre-mRNA processing, Am J Hum Genet 2008;83:77-88.  
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2
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