Introducción

Clostridioides difficile .C. difficile) es un bacilo gram - positivo, anaerobio estricto, con capacidad de formar esporas que permiten su supervivencia. La transmisión por vía fecal - oral convierte al personal de salud, instrumental médico y medio ambiente en importantes fuentes de infección intrahospitalaria. C. difficile puede ser agente causal de colitis pseudomembranosa y de complicaciones como la colitis fulminante, todas ellas englobadas por la denominación infecciones por C. difficile (ICD)^1,2,3,4.

Las cepas toxigénicas de C. difficile producen en el nivel colónico una toxina A o enterotoxina y otra B o citotoxina codificadas en los genes tcdA y tcdB. Ambas tienen efecto citotóxico y causan permeabilidad vascular y hemorragias; además, la enterotoxina induce la acumulación de líquidos y células inflamatorias a través de la activación de la respuesta inflamatoria, mientras que la citotoxina causa destrucción del citoesqueleto del enterocito y es más potente que la primera.Los genes antes mencionados se encuentran ubicados en una región del cromosoma llamada locus de patogenicidad (PaLoc), el cual contiene también 3 genes accesorios: tcdR, tcdE, tcdC. El gen tcdR ha demostrado tener la capacidad de modular positivamente la expresión de los genes de las toxinas, mientras que el tcdC modula negativamente dicha expresión.⁴

La glutamato deshidrogenasa (GDH) es una enzima de la pared del C. difficile muy estable, que se produce en grandes cantidades. La detección del antígeno GDH por inmunocromatografía (IC) es una técnica muy sensible, pero tiene el inconveniente de no poseer una buena especificidad por su capacidad de detectar tanto cepas toxigénicas como no toxigénicas de C. difficile. La combinación de la detección de las toxinas y GDH mediante IC da lugar a resultados muy específicos, pero la sensibilidad es baja para la detección de las primeras. Si bien estas técnicas poseen un elevado valor predictivo negativo (95-100%), la presencia de la GDH en las cepas no toxigénicas hace que el valor predictivo positivo de su detección sea relativamente bajo (50 - 60%). En estos casos, la decisión médica de aislar y tratar al paciente es más difícil. Por este motivo, los métodos inmunocromatográficos no son recomendables como únicos métodos diagnósticos de ICD^5,6,7,8.

La alta sensibilidad y especificidad de las técnicas moleculares permiten un diagnóstico rápido y certero de la ICD, pero son costosas y requieren equipamiento específico. Estos inconvenientes han dado lugar al diseño de varios algoritmos diagnósticos que son costo - efectivos. La mayoría de los mismos utiliza como método de cribado la IC y la búsqueda de la enzima GDH debido a su alta sensibilidad diagnóstica y valor predictivo negativo. Según recomendaciones nacionales e internacionales, los resultados discordantes (GDH +/ Toxinas - o GDH -/Toxinas +) deben confirmarse por un método molecular validado^5,6,8.

En la mayoría de los centros hospitalarios de la Argentina, el diagnóstico de infección por C. difficile se realiza únicamente por IC, con las limitaciones que dicha metodología presenta. Además, son pocos los estudios que comparan distintas metodologías realizadas en Argentina e incluso, en Latinoamérica.

El objetivo del presente estudio fue comparar cuatro distintas metodologías para la detección de C. difficile toxigénico, directamente de la materia fecal: la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR-RT) comercial, la PCR convencional, la inmunocromatografía y el cultivo anaerobio con posterior detección de las toxinas por IC y PCR. El cultivo toxigénico se consideró como método de referencia.

Materiales y Métodos

Se analizaron, en forma prospectiva, muestras consecutivas de materia fecal diarreica de pacientes internados con sospecha de ICD, en el período enero-mayo de 2018. Todas las muestras de materia fecal se procesaron por: inmunocromatografía, PCR en tiempo real, PCR convencional y cultivo toxigénico.

Inmunocromatografía: se utilizó el equipo comercial C. Diff Quick Check Complete ^TM (Techlab, Inc., EE. UU) para la detección de GDH y toxinas A y B. La prueba se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante, directamente sobre muestras de materia fecal y luego, sobre los aislados de heces.

PCR en tiempo real: la PCR-RT, cuya detección se basa en la tecnología de sondas de hibridación, se realizó directamente sobre las muestras de materia fecal y sobre los aislados de C. difficile. La extracción de ADN se efectuó en el equipo automatizado MagNA Pure (Roche Diagnostics). Para la extracción de ADN directamente de la materia fecal, se suspendieron 1 - 2 ansadas de 10 µl de materia fecal diarreica en 1 ml de agua bidestilada estéril. Se vortexeó por 1 minuto seguido de una centrifugación a 6000 rpm durante 1 minuto. Se colocaron 410 µl del sobrenadante en el equipo MagNA Pure (Roche Diagnostics) para su extracción, adicionando 10 µl del control de extracción. Se usó el kit de extracción y purificación de ácidos nucleicos MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit. El protocolo de extracción utilizado fue el otal NA en plasma: 100 - 400; el volumen de elución fue de 100 µl. Luego, se realizó la PCR-RT con el kit de detección de LightMix® Kit Clostridium difficile EC (TIB Molbiol) en el equipo Light Cycler 2.0 (LC, Roche Diagnostics), que detecta la presencia del gen tcdC, presente en todas las cepas toxigénicas. Este, además, es capaz de detectar probables cepas hipervirulentas, con deleción en el gen tcdC, analizando las curvas de melting^9,10,11. Los pasos de amplificación y detección del gen tcdC se realizaron según las instrucciones del fabricante.

Para la extracción de ADN de aislados se suspendieron 2-3 colonias en 1 ml de agua bidestilada estéril. Se tomaron 410 µl de la suspensión y se adicionaron 10 µl del control de extracción. A continuación, se siguieron los mismos pasos que para el procedimiento directo a partir de materia fecal descripto arriba.

PCR convencional: es una PCR de punto final que se realizó directamente sobre las muestras de materia fecal almacenadas a -20°C y sobre los aislados de C. difficile. La extracción y purificación de ADN directamente de materia fecal se realizaron con el kit QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Alemania), a partir de 220 mg de materia fecal, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la extracción de ADN de aislados, se suspendió 1 colonia en 50µl de agua bidestilada estéril, se calentó a 95°C durante 10 minutos y se centrifugó a 15,000 RPM x g por 2 minutos, tomando el sobrenadante para la realización de la PCR. La PCR se realizó utilizando los cebadores NK104 5'-GTGTAGCAATGAAAGTCCAAGTTTACGC-3' y NK105 5′-CACTTAGCTCTTTGATTGCTGCACCT-3′, que amplifican un segmento del gen tcdB, como se describió previamente¹². El ciclado consistió en 5 minutos de desnaturalización a 94°C, seguidos de 40 ciclos de amplificación de 20 segundos a 94°C, 60 segundos a 62°C y 40 segundos a 74°C, cada uno. Al finalizar los ciclos de amplificación, los tubos se incubaron 5 minutos a 72°C. La PCR se consideró positiva frente a la presencia de un producto de amplificación de 270pb correspondiente a un fragmento del gen tcdB. La detección de este fragmento se realizó por electroforesis en gel de agarosa al 2% con GelRed^TM (Biotium).

Cultivo toxigénico: previo al cultivo toxigénico, se realizó shock etanólico (igual volumen de materia fecal y etanol absoluto) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, las muestras de materia fecal tratadas fueron sembradas en el medio selectivo CHROM agar ^TMC. difficile (Medicatec) e incubadas en condiciones anaeróbicas a 37°C por 24h. En dicho medio, las colonias compatibles con C. difficile se ven fluorescentes al exponerlas bajo lámpara de luz UV a 365 nm. La identificación de C. difficile se realizó por la metodología automatizada MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) y la detección de toxina, por IC y amba

Resultados

En el cultivo, se aisló C. difficile toxigénico en 14,4% (14/97) de las muestras de materia fecal. La concordancia de la PCR-RT y PCR convencional fue del 92,9% (13/14) y del 100% (14/14) comparada con el cultivo toxigénico, respectivamente. En 2 de las 13 muestras positivas por PCR-RT, se detectó deleción en el gen tcdC, por análisis de las curvas de melting. Seis muestras fueron positivas para GDH y Tx (Ag+Tx+) por PCR convencional y cultivo toxigénico. De 15 muestras con GDH positiva y toxinas negativas (Ag+Tx-), 7 presentaron ambas PCR y cultivo toxigénico positivos. En 8 muestras con Ag+Tx- y PCR negativas, se aisló C. difficile no toxigénico. Todas las muestras negativas por cultivo también lo fueron por las PCR y por IC. Una muestra negativa para GDH y toxinas (Ag-Tx-) resultó positiva por ambas PCR y cultivo toxigénico, pero se la consideró un falso negativo de la IC (Tabla I).

Usando el cultivo toxigénico como método de referencia, la sensibilidad (S), especificidad (E), el valor predictivo positivo (VPP) y negativo (VPN) de los ensayos fueron del 42,9 %, 100 %, 100 % y 91,2 %, respectivamente, para la detección de toxinas por IC; del 92,9 %, 100 %, 100 % y 98,8 % para la PCR-RT y del 100 %, 100 %, 100 % y 100 % para la PCR convencional (Tabla II).

Discusión

Aunque las técnicas de detección de toxinas A y/o B mediante inmunoanálisis, tales como la inmunocromatografía o el enzimoinmunoanálisis, son técnicas rápidas, sencillas y de bajo costo, su baja sensibilidad (40 - 60%) las descartan como métodos únicos de diagnóstico de infección por Clostridioides difficile^13,14.

La detección del antígeno glutamato deshidrogenasa mediante IC es una técnica muy sensible, con valores cercanos al 90 %, en comparación con el cultivo toxigénico. Sin embargo, tiene el inconveniente de no tener una buena especificidad por su capacidad de detectar tanto cepas toxigénicas como no toxigénicas de C. difficile. En la actualidad, se comercializan inmunocromatografías que detectan simultáneamente GDH y toxinas A y/o B. La combinación de la detección de las toxinas y de la GDH mediante IC da lugar a resultados muy específicos, pero su sensibilidad queda limitada por la técnica menos sensible, es decir, por la detección de las toxinas. En el presente estudio, la sensibilidad de la IC para la detección de toxinas fue baja, del 42,9 %. Estos resultados concuerdan con lo previamente descripto.

Por otro lado, los elevados valores de VPP y VPN obtenidos, superiores al 90%, convierten a esta IC, que combina la detección de GDH y toxinas, en un excelente método de cribado^15,16,17.

La alta sensibilidad y especificidad de las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos de C. difficile las convierten en ideales para el diagnóstico rápido de la ICD, pero por su costo elevado y mayor complejidad no están al alcance de la mayoría de los laboratorios. Esta falta de métodos accesibles y eficaces, utilizables como métodos únicos para el diagnóstico rápido de la ICD ha dado lugar al diseño de varios algoritmos diagnósticos que aprovechan lo mejor de cada una de las técnicas que los integran.

La mayoría de los algoritmos diagnósticos utilizan como método de cribado la detección mediante IC de la enzima GDH debido a su alta sensibilidad diagnóstica. Sin embargo, como su especificidad no es buena, se utilizan técnicas confirmatorias para los resultados GDH positivos. De esta forma, los resultados GDH positivos son confirmados por la detección de las toxinas por IC y, en caso de discordancia (Ag+ / Tx-), se utilizan las técnicas moleculares. Los estudios que han evaluado los algoritmos que incluyen inmunocromatografías que detectan las toxinas son capaces de reducir en casi un 50 % el número de pruebas moleculares necesarias, con el consiguiente ahorro en el uso de estas técnicas diagnósticas^15,16,17,18.

Algunos métodos de amplificación de ácidos nucleicos, dirigidos al diagnóstico tienen como diana el gen de la toxina B (tcdB) o incluso los genes de ambas toxinas. Los métodos basados únicamente en la detección del gen tcdA no están aconsejados debido a que pueden no detectar algunas cepas con deleciones en dicho gen. Otros equipos tienen como diana el gen supresor tcdC, presente en todas las cepas toxigénicas¹⁹. En el actual estudio se compararon dos PCR diferentes, una PCR en tiempo real y una PCR convencional, a su vez, dirigidas a distintos blancos moleculares. Ambas PCR presentaron resultados de S, E, VPP y VPN superiores al 90 %, por lo que son métodos muy útiles para confirmar y descartar ICD.

Sobre la base de nuestros resultados, podemos concluir que los métodos moleculares poseen una S y E superiores a la IC. A pesar de la baja sensibilidad,la IC sigue siendo muy útil como método de cribado en laboratorios debido al elevado VPN y la rapidez para obtener un resultado. Sin embargo, frente a resultados inconclusos (Ag+Tx-), recomendamos la realización de un método molecular para llegar al diagnóstico de certeza.

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