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Citometría de flujo multiparamétrica para el diagnóstico y monitoreo de poblaciones deficientes en glicosilfosfastidil inositol  
REVISIÓN  
Citometría de flujo multiparamétrica para el diagnóstico y  
monitoreo de poblaciones deficientes en glicosilfosfastidil  
inositol  
Nuñez, N.A.; Novoa, V.; Guevara, R.; Carballo, O.G.  
Laboratorio de Inmunología, Unidad de Inmunología e Histocompatibilidad; Hospital Carlos G. Durand. CABA, Argentina.  
Contacto: Nuñez, N.A.; nerinunez@fibertel.com.ar  
RESUMEN  
La hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) es un trastorno clonal severo, poco frecuente, no  
maligno y adquirido de la célula madre hematopoyética, causado por una anomalía de la membrana  
eritrocitaria como resultado de una mutación somática clonal de un gen: el fosfatidilinositol glucano  
clase A (PIG-A) situado en el brazo corto del cromosoma X. Se han identificado una serie de proteí-  
nas reguladoras del complemento, entre las que se destacan: el factor acelerador de la degradación  
(CD55) y el factor inhibidor de la lisis reactiva de la membrana (CD59) deficientes en esta enferme-  
dad. La HPN se clasifica en: clásica, asociada a otro trastorno medular y subclínica. Esta enfermedad  
está caracterizada por una hemólisis intravascular crónica mediada por complemento resultando en  
anemia, mayor riesgo de trombosis y citopenias por falla medular. Las manifestaciones clínicas pue-  
den ser muy variadas dependiendo del tamaño del clon HPN. Algunos pacientes con clones HPN muy  
pequeños pueden no presentar síntomas. La HPN está frecuentemente asociada con anemia aplásica  
y mielodisplasia hipoplásica. Actualmente la citometría de flujo multiparamétrica constituye la técni-  
ca de elección para el diagnóstico y monitoreo de esta enfermedad. Se han realizado varios consensos  
y publicado guías diagnósticas para mejorar la estandarización y la sensibilidad de esta técnica que  
permite identificar y cuantificar el clon HPN en células sanguíneas como ser neutrófilos, monocitos  
y eritrocitos. Recientemente, el anticuerpo monoclonal eculizumab ha aumentado la expectativa de  
vida de estos pacientes con una mejoría de su calidad de vida.  
Palabras clave: hemoglobinuria paroxística nocturna, hemólisis, citometría de flujo, clon HPN, eculi-  
zumab.  
Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is a low-frequency, severe, non-malignant acquired  
clonal disease of the haematopoietic stem cell, caused by an erythrocyte membrane anomaly, as a  
result of a somatic clonal mutation of the phosphatidylinositol glycan class A (PIG-A) gene located  
in the short arm of the X chromosome. Several complement-regulatory proteins, including Decay  
Accelerating Factor (CD55) and Membrane Inhibitor of Reactive Lysis (CD59), have been identified as  
deficient in this pathology. PNH is classified as either classic, in the setting of another bone marrow  
disorder, or subclinical. The disease is characterized by complement-mediated chronic intravascular  
haemolysis resulting in anaemia, risk of thrombosis and pancytopenia caused by bone marrow  
failure. Clinical manifestations vary depending on the clone size and some patients with small PNH  
clones may not present clinical symptoms. PNH is frequently associated with aplastic anaemia and  
hypoplastic myelodysplasia. At present, multiparameter flow cytometry, which allows identification  
and quantification of PNH clones in neutrophils, monocytes and erythrocytes, is the test of choice  
ABSTRACT  
ISSN 1515-6761 Ed. Impresa for the diagnosis and monitoring of PNH treatment. Several consensuses have been reached and  
ISSN 2250-5903 Ed. CD-ROM  
Código Bibliográfico: RByPC  
diagnostic guides have been published to improve the standardization and sensitivity of this test.  
Fecha de Recepción:  
1/05/2015.  
Fecha de Aceptación:  
1/07/2015.  
Recently, the monoclonal antibody eculizumab has increased life expectancy, improving the quality  
of life in these patients.  
Key word: paroxysmal nocturnal haemoglobinuria, hemolisis, flow cytometry, PNH clone, eculizumab.  
0
0
ByPC 2015;79(3):34-42.  
Citometría de flujo multiparamétrica para el diagnóstico y monitoreo de poblaciones deficientes en glicosilfosfastidil inositol  
35  
Introducción  
HPN consistía en una mayor susceptibilidad a la lisis por el  
La hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) es una complemento10  
anemia hemolítica crónica, producida por un trastorno clo-  
.
nal severo, raro, no maligno y adquirido de la célula precur- Etiopatogenia  
sora hematopoyética. Este trastorno es causado por una  
La HPN es un trastorno hemolítico adquirido en el que la  
mutación somática en el gen fosfatidilinositolglucano clase lesión primaria es producida por una mutación somática y  
A (PIG-A), que se encuentra en el cromosoma X al final del clonal de la célula madre hematopoyética en la biosíntesis  
brazo corto (Xp22.1). Este gen codifica una proteína involu- de GPI. La carencia total o parcial de la expresión de las pro-  
crada en la síntesis del glicosilfosfatidilinositol (GPI), el cual teínas de la membrana ancladas a través del GPI provocan  
le sirve como anclaje a muchas proteínas de la membrana una sensibilidad anormal al complemento1, 3  
.
celular. El resultado de la pérdida de estas proteínas de la  
En la biosíntesis del anclaje al GPI están involucradas al  
superficie celular es un aumento de la sensibilidad a la des- menos 10 reacciones y más de 20 genes diferentes. Dos de  
1
trucción celular mediada por el complemento .  
las proteínas, el factor acelerador de la degradación (DAF,  
Desde el punto de vista clínico, la HPN se caracteriza por CD55) y el factor inhibidor de la lisis reactiva de membra-  
una hemolisis intravascular, con tendencia a la anemia y na (ILRM, CD59), que inhiben la activación y la función ci-  
trombosis, y un componente variable de insuficiencia me- tolítica del complemento respectivamente, son postuladas  
2
dular .  
como las de mayor importancia en la fisiopatología de la  
En la actualidad se considera a la HPN como una enfer- enfermedad ,2,11,12.  
medad sistémica, en la que varios órganos pueden estar  
1
Los primeros defectos observados en la superficie de las  
implicados, especialmente el hígado, el riñón, el sistema células sanguíneas maduras en esta enfermedad fueron la  
3
, 4  
nervioso central, el pulmón y/o el corazón . La hemoglo- disminución de la acetilcolinesterasa en los hematíes y de  
2
binuria, signo que da nombre a la enfermedad, puede no ser la fosfatasa alcalina en los leucocitos .  
objetivable; tan sólo el 26% de los casos la presentan al ini-  
En este momento, ya son más de 20 las proteínas de  
cio, y el 62% en algún momento a lo largo del curso evoluti- membrana cuya expresión se ha encontrado disminuida o  
5
3
,13,14  
(tabla I) de ellas, sólo 6 tienen trascendencia  
vo de la enfermedad.  
ausente  
Es una entidad poco frecuente con gran variabilidad clíni- clínica y la expresión de la enfermedad depende del tipo de  
ca. Su incidencia es de aproximadamente 1/100.000 casos proteína de membrana que falta y del grado de la alteración  
por cada cien mil habitantes por año. La mortalidad es del 50 de su función 1,12,15-17.  
1
%
con una mediana de supervivencia de 22 años. Más del 60 %  
(Ver Tabla 1)  
1,2  
de las muertes son causadas por trombosis y hemorragias  
.
Afecta a los dos sexos a cualquier edad, aunque es más fre- Características clínicas  
cuente en adultos del sexo femenino y aparece entre los 16  
La HPN es una enfermedad clonal sistémica que puede  
y 75 años, con una edad promedio de 42 años, aunque se ha involucrar a varios órganos como: hígado, riñón, pulmón,  
descrito también en niños y en ancianos. Su comienzo es in- SNC y/o corazón. Se caracteriza principalmente por hemóli-  
1
sis intravascular, trombosis y falla medular18, 19.  
sidioso y su evolución es prolongada y variable .  
Su principal manifestación clínica es la hemólisis intra-  
vascular generando hemoglobinuria y anemia. El 26% de los  
Antecedentes históricos  
La HPN fue descrita inicialmente en Londres, Inglaterra pacientes presentan hemoglobinuria al inicio, sin embargo  
por William Gull en 1866, quien observó que el pigmento ex- el 62% tienen hemoglobinuria en algún momento del curso  
6
20  
de la enfermedad . La hemólisis intravascular provoca li-  
cretado en orina no correspondía a eritrocitos .  
En 1882 Paul Strübing describió la asociación entre la beración de hemoglobina (Hb) y aumento del secuestro del  
7
hemoglobinuria y el ejercicio físico . Aunque no existieron óxido nítrico (ON) que se une a la Hb libre. La disminución  
méritos mayores en la descripción de la HPN en los trabajos del ON produce vasoconstricción periférica y distonía del  
de Marchiafava y Micheli en 1911 y 1931, sus nombres han músculo liso lo que se evidencia por dolor abdominal, dis-  
sido utilizados como epónimos de esta enfermedad. Por jus- fagia, espasmo esofágico, disfunción eréctil y astenia pro-  
ticia académica el epónimo que le corresponde a la HPN es funda con una importante alteración de la calidad de vida en  
2
1, 22  
.
el de “Enfermedad de Gull-Strübing”.  
algunos pacientes  
La trombosis es la complicación clínica más severa y la  
El nombre de la enfermedad , hemoglobinuria paroxísti-  
ca nocturna, es controvertido en cuanto a lo que su defini- principal causa de muerte en estos pacientes. Ocurre apro-  
ción implica, ya que éste parece equivocado, debido a que ximadamente en el 40% de los casos con HPN. La etiología  
la hemoglobinuria habitualmente no es nocturna y sólo es de la trombosis es multifactorial estando involucradas tan-  
8
uno de los signos asociados a la HPN . El nombre de HPN to la cascada del complemento, la cascada de la coagula-  
9
21  
fue establecido en 1928 por Enneking. Sin embargo fueron ción como la hemólisis intravascular . Aunque los eventos  
las observaciones de Thomas Hale Ham en 1937, las que le trombóticos pueden ocurrir en cualquier sitio, los pacientes  
permitieron proponer que el defecto de los eritrocitos en la con HPN presentan con más frecuencia trombosis en sitios  
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Citometría de flujo multiparamétrica para el diagnóstico y monitoreo de poblaciones deficientes en glicosilfosfastidil inositol  
Tabla I. Proteínas unidas a la GPI: función y distribución celular.  
Proteína unida a GPI  
Función  
Distribución  
Monocitos y macrófagos  
CD14  
CD16  
Receptor de lipopolisacáridos  
Receptor Fc de complejos inmunes Ig G  
Activación y diferenciación de linfocito B.  
Producción de H O en neutrófilos  
Neutrófilos  
CD24  
Linfocitos B y neutrófilos  
2
2
CD48  
CD52  
CD55  
Molécula de adhesión. Activación linfocitaria  
Desconocida  
Linfocitos, monocitos y células progenitoras.  
Linfocitos, monocitos y neutrófilos  
Regulación de la activación del complemento  
Todas las células hematopoyéticas  
Molécula de adhesión. Regulación de la respuesta  
inmune  
Inhibe la formación del complejo de ataque de  
membrana del complemento  
CD58  
Todas las células hematopoyéticas  
Todas las células hematopoyéticas  
Neutrófilos  
CD59  
CD66b,c,e  
Desconocida  
Ecto-5 nucleotidasa. Adhesión celular. Señal de  
coestimulación  
Urokinasa. Receptor del factor activador del  
plasminógeno  
CD73  
CD87  
Subpoblación de Linfocitos B y T  
Linfocitos T, célula NK, monocitos y neutrófilos  
Subpoblaciones de Linfocitos T y células  
progenitoras.  
Eritrocitos y linfocitos  
Células progenitoras., plaquetas, monocitos,  
neutrófilos y linfocitos T activados  
CD90  
Desconocida  
Desconocida  
Desconocida  
CD108  
CD109  
CD157  
Ectoenzima. Mediador de adhesión y migración.  
Enzima  
Neutrófilos, monocitos,  
Acetilcolinesterasa  
Eritrocitos  
Fosfatasa alcalina del  
neutrófilo  
Enzima  
Neutrófilos  
ADP-ribosiltransferasa Enzima  
Subpoblación de linfocitos T y neutrófilos  
Cromer  
Ag sanguíneos eritrocitarios  
Eritrocitos  
Eritrocitos  
Eritrocitos  
Eritrocitos  
Eritrocitos  
Neutrófilos  
Neutrófilos  
Cartwright/Yt  
John Milton Hagen  
Dombrock  
Ag sanguíneos eritrocitarios  
Ag sanguíneos eritrocitarios  
Ag sanguíneos eritrocitarios  
Ag sanguíneos eritrocitarios  
Ag del neutrófilo  
Holley- Gregory  
NA1/NA2  
NB1/NB2  
Ag del neutrófilo  
CD: cluster de diferenciación, Fc: fracción constante de la inmunoglobulina, Ig: inmunoglobulina, ADP: Adenosindifosfato,  
Ag: antígenos.  
inusuales como en venas hepáticas (síndrome de Budd-  
En pacientes con diagnóstico de anemia aplásica (AA)  
Chiari), venas abdominales, cerebrales, dérmicas y de la o de síndrome mielodisplásico (SMD) se ha identificado la  
2
4,25  
. Un 50-80% de las AA y un 12%-  
retina. Un 15% de las trombosis se producen a nivel arterial presencia de clones HPN  
pudiendo afectar las arterias cerebrales y coronarias. En las 23% de los SMD presentan clones HPN  
mujeres el embarazo aumenta el riesgo trombótico y la mor- de los casos los clones HPN identificados son de pequeño  
2
6,27  
. En la mayoría  
1
9,20,23  
bimortalidad materno-fetal  
.
tamaño (<1%). Los pacientes con AA que presentan clones  
La disminución de la hematopoyesis como consecuencia HPN (+) tienen mejor respuesta al tratamiento inmunosu-  
de la falla medular puede producir citopenias. Otras mani- presor y un pronóstico más favorable. Por otro lado, la pre-  
festaciones clínicas que se pueden observar son insuficien- sencia de clones HPN se observa principalmente en los SMD  
cia renal, hipertensión pulmonar e infecciones. La insufi- de bajo riesgo, particularmente en la variante de anemia  
ciencia renal puede ser aguda, generalmente reversible, o refractaria. Estos pacientes tienen algunas características  
crónica. La hipertensión pulmonar es causante también de clínicas diferentes como, por ejemplo, menos alteraciones  
disnea y fatiga22  
.
morfológicas en glóbulos rojos y menos anormalidades ca-  
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Citometría de flujo multiparamétrica para el diagnóstico y monitoreo de poblaciones deficientes en glicosilfosfastidil inositol  
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riotípicas, mayor incidencia de HLA-DR15, menor progresión cientes que han recibido con anterioridad transfusiones de  
a leucemia aguda y mayor respuesta a la terapia con inmu- concentrados de hematíes, pues presentan pequeños clo-  
nosupresores28  
.
nes de hematíes HPN, lo que da lugar a falsos negativos  
23  
.
Existe una gran variabilidad en la expresión de los sínto-  
El análisis por citometría de flujo de la expresión de pro-  
mas clínicos en la HPN. En algunos casos se presentan sín- teínas ancladas a GPI surgió como un método complemen-  
tomas muy graves e incapacitantes, mientras que en otros tario al test anterior. Comenzó a utilizarse en 1985, cuando  
tienen escasa sintomatología. Los síntomas también pue- dos grupos independientes de investigadores usaron la ci-  
den variar en el tiempo en un paciente dado.  
tometría de flujo y un anticuerpo dirigido contra CD55, para  
La International PNH Interest Group propuso una clasifi- investigar pacientes con HPN. Sus estudios demostraron  
2
9-31  
:
cación que incluye 3 categorías de HPN  
poblaciones de hematíes, neutrófilos, monocitos, linfoci-  
1
2
3
-
-
-
HPN clásica: pacientes con hemólisis intravascular y/o tos y plaquetas deficientes en CD55, lo cual confirmó que  
trombosis. Otros síntomas clínicos también presentes la HPN era un desorden de la célula madre hematopoyética.  
son la anemia, la fatiga, la disfunción eréctil, la disfagia, Desde entonces la citometría de flujo se ha aplicado satis-  
el dolor abdominal, la falla renal, etc. No hay evidencia factoriamente en el estudio de muestras de pacientes con  
de falla medular y en general presentan clones HPN de HPN, hasta convertirse en el método de elección para el  
2
3,32  
.
gran tamaño (≥ 50%).  
HPN en el contexto de otra patología hematológica:  
diagnóstico de laboratorio de esta enfermedad  
En la actualidad, el diagnóstico inequívoco requiere la  
pacientes con evidencia clínica y/o de laboratorio de demostración de la deficiencia de al menos 2 proteínas, an-  
hemólisis intravascular, que presentan otra patología cladas a GPI en al menos 2 poblaciones celulares diferentes,  
hematológica primaria como AA o SMD. En la mayoría con el fin de excluir los casos que presentan deficiencias  
de ellos se observan clones HPN pequeños (<30%). La congénitas de un solo antígeno y obviar algunos problemas  
2
3
.
falla medular es la que domina el cuadro clínico.  
HPN subclínica: pacientes que presentan clones HPN  
técnicos  
La muestra de elección para el estudio de HPN es san-  
pequeños (en general <1%) por citometría de flujo, no gre periférica y merece destacarse que habitualmente es  
tienen síntomas clínicos ni evidencia de hemólisis. Se desaconsejable realizar el rastreo de HPN en muestras de  
asocia típicamente a aplasia medular.  
médula ósea, ya que la expresión de proteínas ancladas a  
GPI depende del estadio madurativo de las diferentes series  
hematopoyéticas, lo que complica de forma innecesaria el  
Diagnóstico de HPN  
Las guías internacionales recomiendan el estudio de análisis23  
.
clones HPN por citometría de flujo en pacientes que mani-  
Teniendo en cuenta la expresión de la proteína anclada  
a GPI, los clones de HPN se dividen en tipo I (si la expresión  
de proteína anclada a GPI es normal), tipo II (si la deficien-  
fiestan18,20,29,31:  
1
2
-
-
Hemoglobinuria.  
Hemólisis intravascular Coombs directa negativa de cia es parcial, es decir, se observa una expresión débil de la  
causa inexplicada, aumento de LDH en suero y espe- proteína anclada a GPI) y tipo III (si la deficiencia es total)31  
cialmente en pacientes con deficiencia de Fe. El estudio de las proteínas asociadas a GPI debe combi-  
.
3
-
Trombosis no explicadas venosa o arteriales en pacien- narse con el marcaje adicional de anticuerpos monoclona-  
tes jóvenes o con trombosis en sitios inusuales: síndro- les, que permitan la identificación correcta e inequívoca de  
me de Budd-Chiari, venas portal o mesentéricas, venas las subpoblaciones de interés. Las poblaciones celulares  
cerebrales o dérmicas.  
Disfagia intermitente o dolor abdominal de etiología no sión de dichas proteínas son: las poblaciones leucocitarias  
explicada con evidencia de hemólisis intravascular. de neutrófilos y monocitos, puesto que, dentro de las po-  
Citopenias idiopáticas o mantenidas de significado in- blaciones celulares representadas en sangre periférica en  
cierto. número suficiente, éstas constituyen las subpoblaciones  
Pacientes con diagnóstico de AA, al diagnóstico y anual- celulares que suelen mostrar mayor grado de afectación,  
mente. debido a su corta vida media. Cuando se evidencia un defec-  
Pacientes con diagnóstico de SMD hipoplásico, espe- to en la expresión de proteínas ancladas a GPI en neutrófilos  
más adecuadas para la identificación del déficit de expre-  
4
5
6
7
-
-
-
-
cialmente en pacientes jóvenes.  
Durante muchos años el test de Ham, o prueba de la he- evaluación de los hematíes  
y monocitos, conviene completar el estudio a través de la  
18  
.
mólisis ácida, ha sido el método de elección para el diagnós-  
tico de HPN. Esta prueba de laboratorio se fundamenta en Análisis de eritrocitos  
el principio de que los hematíes de pacientes con HPN son  
Durante muchos años, el diagnóstico de HPN por citome-  
más sensibles a la acción de las proteínas del sistema del tría de flujo se ha centrado en el análisis de la expresión de  
complemento, cuando se activan en un medio ácido. Si bien, las proteínas ancladas a GPI en la superficie de los eritro-  
es una técnica específica, la principal limitación reside en citos. Esto se debe, fundamentalmente, a que la manifes-  
que su sensibilidad es relativamente baja, sobre todo en pa- tación clínica más característica de la enfermedad es la  
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Citometría de flujo multiparamétrica para el diagnóstico y monitoreo de poblaciones deficientes en glicosilfosfastidil inositol  
hemólisis intravascular y a que las técnicas empleadas con clon HPN. Pero el análisis de hematíes es importante, pri-  
anterioridad a la citometría, como el test de Ham o la prueba mero, porque, la determinación de la distribución de células  
de la sacarosa, estaban dirigidas de forma específica a la tipo I, II y III puede predecir el fenotipo clínico: los pacien-  
2
3
identificación de la alteración en los hematíes . El ensayo tes con clones tipo III mayor a 20% casi siempre presentan  
en eritrocitos fue el primero en ser utilizado para detectar evidencia clínica de hemólisis; y segundo, es útil para eva-  
HPN, ya que se comprobó inicialmente que la deficiencia de luar la eficacia de respuesta al tratamiento con eculizumab,  
CD55 y CD59 eran centrales en la patofisiología de la enfer- dado que esta droga inhibe la lisis de las células mediada  
medad. El CD59 se expresa en altos niveles en los hematíes, por complemento, los eritrocitos anormales sobreviven y  
3
1
mientras que el CD55 es menos abundante en los mismos  
.
la proporción de los mismos aumenta, reflejando el tamaño  
31,34  
Mientras que la pérdida de CD55 y CD59 se usaba tradi- del clon  
cionalmente para detectar eritrocitos HPN, los ensayos de  
.
rutina basados solamente en CD55 y/o CD59 no son sensi- Análisis de neutrófilos y monocitos  
bles para detectar clones menores de 1-2%, siendo inade-  
La proporción de neutrófilos y monocitos anómalos refle-  
cuados para detectar clones pequeños que se encuentran ja mejor la actividad de la célula madre alterada en HPN, ya  
generalmente en casos de AA o SMD o incluso en casos que su vida media es habitualmente corta, tanto en indivi-  
de pacientes transfundidos. Además, el CD55 es inferior duos sanos como en HPN; por el contrario, la vida media de  
al CD59 porque no permite la separación eficiente en tipo los hematíes es más larga y está significativamente acor-  
2
3
I, II y III. Para el análisis de eritrocitos de alta sensibilidad, tada en los pacientes con HPN . Por lo tanto, el estudio de  
las guías ICCS (International Clinical Citometry Society) re- los neutrófilos y monocitos está ampliamente reconocido  
comiendan el uso de CD235a o Glicoforina A, actualmente, como el mejor método para evaluar el verdadero tamaño del  
único reactivo disponible para identificar específicamente clon HPN31  
.
eritrocitos maduros, y CD59, para detectar las células defi-  
En la mayoría de los pacientes con HPN, el clon de neu-  
trófilos es mayor al clon de eritrocitos. Esta diferencia es,  
cientes en GPI3  
1,33  
.
El análisis de los hematíes en un paciente no transfundi- seguramente, debida a la vida media corta de los eritroci-  
do permite la evaluación más precisa de la distribución de tos de HPN, comparada con los eritrocitos normales y ade-  
las poblaciones tipo I, II y III (Figura 1).  
Se observa una variación marcada en la distribución de neas . Generalmente, el tamaño del clon de neutrófilos y  
estas subpoblaciones de paciente a paciente y la separa- monocitos es similar31  
ción entre los tres tipos, a veces, no es clara. Estudios re- Históricamente, el CD55 y el CD59 fueron los primeros  
más puede estar complicada por las transfusiones sanguí-  
32  
.
cientes demostraron que los hematíes tipo III sobreviven marcadores utilizados para detectar clones HPN en neutró-  
entre 17 y 60 días y que los eritrocitos tipo II, cuando expre- filos y monocitos en virtud de la experiencia previa que se  
san al menos 15% de cantidad normal de CD59, son protegi- tenía del estudio de hematíes. Sin embargo, dichos marca-  
3
2
dos de la lisis mediada por complemento  
.
dores, generalmente, poseen una menor separación entre  
El estudio solamente de eritrocitos no es adecuado para las poblaciones negativas y positivas, poseen altos coefi-  
la evaluación de pacientes con HPN debido a la hemólisis y cientes de variación y dan tamaños de clones menores que  
a las transfusiones que pueden subestimar el tamaño del otros antígenos anclados a GPI, motivos por los cuales no  
Figura 1. Histograma de la expresión de CD59 en eritrocitos en muestra de sangre periférica por citometría de flujo. Se  
observan la presencia de clones HPN tipo I (expresión normal), tipo II (expresión parcial) y tipo III (ausencia de expresión).  
ByPC 2015;79(3):34-42.  
Citometría de flujo multiparamétrica para el diagnóstico y monitoreo de poblaciones deficientes en glicosilfosfastidil inositol  
39  
son óptimos para el estudio de HPN.  
los reactivos más confiables y la SEHH, FLAER y CD157.  
Para la selección adecuada de .neutrófilos se han pro-  
En el presente, se posee experiencia en un gran número  
de marcadores como CD16, CD24, CD66b para neutrófilos, puesto el CD15 y CD10, mientras que, para la detección de  
CD14 para monocitos y CD157 y FLAER para ambos leuco- monocitos el CD64 es el más efectivo, porque otra alterna-  
3
1
citos  
.
tiva propuesta anteriormente como el CD33 se ha compro-  
El CD16 merece una mención especial, dado que existen bado que falla en la marcación, como es el caso de algunos  
polimorfismos en la población que no son reconocidos por pacientes 0,31,34.  
2
algunos anticuerpos anti-CD16, puede perderse en pacien-  
Para el análisis de alta sensibilidad de leucocitos, la se-  
tes con SMD y no se expresa en estadíos celulares inmadu- lección según parámetros de dispersión de luz (SSC/FSC) o  
ros, por lo cual se recomienda que el estudio de este antíge- el uso del marcador pan-leucocitario CD45, no es aceptable  
3
1
no sea en combinación con otro reactivo  
.
puesto que pueden aparecer eventos espúreos que no sean  
FLAER es un derivado fluorescente de la toxina bacte- neutrófilos o monocitos, los cuales podrían llevar a una falsa  
riana aerolisina que se une específicamente a la molécula conclusión de la presencia de una población HPN. Para una  
GPI y se ha convertido, probablemente, en el reactivo más selección más precisa, se requiere un marcador de linaje  
3
5
.
útil en la detección de clones HPN en glóbulos blancos  
Se ha demostrado que el CD157 conjugado con ficoeritrina trófilos y CD64 para monocitos, combinado con parámetros  
CD157 PE) es superior al CD24 PE en el ensayo de neutró- de dispersión de luz y CD45 para mejorar la precisión de la  
como se mencionó anteriormente, CD15 o CD10 para neu-  
(
filos y superior al CD14 PE en el ensayo de monocitos, La selección de las poblaciones. Además, es esencial usar más  
ventaja de FLAER y de CD157 es que permiten la detección de un marcador de proteína anclada a GPI. FLAER es particu-  
2
1, 32  
(Figura 2).  
simultánea tanto de neutrófilos como monocitos con alta larmente útil para este tipo de análisis  
sensibilidad36  
.
En cuanto a la adquisición de eventos de interés en el  
El uso de los distintos marcadores difiere según el grupo citómetro, se obtienen, generalmente, 50.000 neutrófilos,  
de investigadores. Para la detección de clones HPN de neu- y para detectar clones pequeños de HPN, se pueden con-  
3
1
trófilos, Borowitz y col. (Guías ICCS) propusieron que los seguir 250.000 eventos asegurando, de esta manera, la  
anticuerpos CD24, CD66b, CD16, junto con FLAER, son los confiabilidad de los datos. Para los monocitos, se logran,  
3
4
reactivos más confiables; Sutherland y col. seleccionaron generalmente, entre 5.000 y 10.000, y para la detección de  
a CD24 y FLAER como los reactivos más específicos de GPI, clones pequeños de HPN, se pueden colectar hasta 25.000  
3
4
.
mientras que la Sociedad Española de Hematología y Hemo- monocitos  
terapia (SEHH), en su actualización del 2014 de la Guía de Los ensayos de alta sensibilidad no son necesarios para  
2
0
HPN , propuso CD157 y FLAER como primera alternativa. el diagnóstico de HPN clásica, pero son útiles para la detec-  
Para la detección de clones HPN de monocitos, tanto Bo- ción de pequeñas poblaciones HPN en pacientes con desór-  
rowitz como Sutherland identificaron a CD14 y FLAER como denes de falla medular (AA y MDS).  
Figura 2. Gráficos de citometría de flujo para la detección y cuantificación de clones HPN en neutrófilos y monocitos.  
ByPC 2015;79(3):34-42.  
40  
Citometría de flujo multiparamétrica para el diagnóstico y monitoreo de poblaciones deficientes en glicosilfosfastidil inositol  
Análisis de linfocitos  
La HPN clásica es la única que requiere tratamiento  
A pesar de afectar a una célula madre hematopoyética, el específico. El uso de eculizumab y el trasplante de médu-  
análisis de la expresión de proteínas ancladas a GPI en linfo- la ósea alogeneico son hasta el momento las únicas tera-  
citos no se recomienda para el diagnóstico de HPN, debido pias efectivas. El eculizumab es un anticuerpo monoclonal  
a que la proporción de células afectadas entre los linfocitos humanizado que bloquea la proteína C5 del complemento,  
puede ser mínima y sumamente variable de unos pacientes disminuyendo las complicaciones de la HPN que son conse-  
a otros23. Cuando se compara con el tamaño del clon HPN cuencia directa de la hemólisis intravascular. No solo mejo-  
de granulocitos, el clon en linfocitos B, T y células NK es ge- ra la anemia y los requerimientos transfusionales, sino que  
neralmente menor. Esta diferencia se puede explicar por la mejora también los síntomas relacionados con la distonía  
larga vida media de los linfocitos residuales normales, que del músculo liso, la fatiga, la función renal, reduce la inci-  
3
2
.
se generan antes del comienzo de la enfermedad  
dencia de trombosis, disminuye la hipertensión pulmonar y  
mejora significativamente la calidad de vida de los pacien-  
3
7,38  
Análisis de plaquetas  
tes  
. El trasplante de médula ósea alogénico es el único  
La utilidad diagnóstica y relevancia clínica del estudio de tratamiento potencialmente curativo de esta enfermedad,  
3
2
39  
las plaquetas en HPN no ha sido establecida  
.
pero tiene un alto riesgo de morbimortalidad , siendo ésta,  
la única opción en pacientes que no responden al eculizu-  
mab.  
Informe de resultados en el estudio de HPN por  
citometría de flujo  
En el informe deben constar los anticuerpos monoclona- Conclusiones  
les utilizados, tanto para la identificación de las poblaciones  
La HPN es una enfermedad clonal benigna, poco frecuen-  
celulares, como para el estudio de las proteínas ancladas a te, que afecta principalmente a individuos jóvenes. Sus ma-  
GPI. Asimismo, debe detallarse el tamaño de los clones tipo nifestaciones clínicas son muy variadas y multisistémicas,  
II y tipo III de cada población estudiada y también el tamaño encontrándose individuos asintomáticos o con síntomas  
total del clon (tipo II + tipo III) de las diferentes poblaciones leves, hasta pacientes con un gran deterioro en la calidad  
celulares.  
de vida y/o con compromisos graves que pueden causarle  
Si solo se detecta un clon menor, es preferible incluir una la muerte. Los nuevos avances en el manejo de esta enfer-  
aclaración que indique que no es equivalente al diagnóstico medad están vinculados al aporte de la citometría de flujo  
de HPN clásica3  
1
.
multiparamétrica, como diagnóstico y control, y a las nue-  
vas drogas terapéuticas como el eculizumab que, si bien,  
no curan la enfermedad, disminuye el riesgo de complica-  
Seguimiento  
Una vez realizado el diagnóstico de HPN, se debe moni- ciones graves y mejora notablemente la calidad de vida. La  
torear el tamaño del clon HPN en forma regular, puesto que citometría de flujo no solo permite el diagnóstico de HPN  
puede haber cambios en éste (aumentar o disminuir sus clásica con una alta sensibilidad, identificando y cuanti-  
medidas) lo que puede reflejar cambios en la clínica del pa- ficando clones HPN, sino que también permite identificar  
ciente. En áquellos con AA, que presentan pequeños clones muy pequeños clones (<1%) en pacientes asintomáticos y  
HPN, es importante el control porque pueden progresar de con otras patologías hematológicas asociadas, lo que es de  
la forma subclínica a la forma clásica y esto es precedido valor pronóstico y terapéutico.  
por el aumento en el tamaño del clon. En SMD también se  
debe realizar el monitoreo del clon, aunque su progreso no Referencias bibliográficas  
ha sido aún demostrado. El monitoreo debe realizarse cada 1. Morado M, Subirá D, López M. Hemoglobinuria paro-  
6
a 12 meses o ante cualquier cambio en la clínica del pa-  
xística nocturna: nuevos tratamientos y recomenda-  
ciones generales para su diagnóstico. Med Clin. 2010;  
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2
9,31  
ciente  
.
Tanto en los casos tratados con eculizumab como en  
aquellos que fueron trasplantados debe realizarse un moni- 2. Luzzatto L, Risitano AM, Notaro R. Paroxysmal noctur-  
toreo anual, como control.  
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2
Tratamiento  
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El tratamiento de esta enfermedad va a depender de la  
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forma clínica que presenta el paciente. La HPN subclínica, 4. Rother R B, Bell L, Hillmen P et al. The clinical sequelae  
la cual no presenta síntomas, no requiere tratamiento. Sola-  
mente debe monitorearse el tamaño del clon HPN cada 6 o  
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12 meses porque puede haber aumento del clon y evolucio-  
nar a una forma clásica. En el caso de HPN asociada a AA o 5. Parker C, Omine M, Richards S et al. Diagnosis and ma-  
SMD el tratamiento está relacionado con la enfermedad pri-  
maria, inmunosupresores o trasplante de médula ósea  
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1
9,22  
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