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Uso del inmunoblot(Western blot) en el laboratorio clínico para la detección de distrofina, disferlina y calpaína 3:  
tres proteínas de relevancia en el diagnóstico de miopatías hereditarias.  
ARTÍCULO ORIGINAL  
Uso del inmunoblot (Western blot) en el laboratorio  
clínico para la detección de distrofina, disferlina y  
calpaína 3: tres proteínas de relevancia en el diagnóstico  
de miopatías hereditarias  
Sorroche, P.B .;Cucci, M. ;Wilda, M. ;Ruggiero, M. F . ;Bettini ,M. ;Giménez, M.I .;Christiansen, S.; Grigera, P.R.4*  
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1
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2
2
1
3
1.  
Sección de Proteínas, Laboratorio Central, Hospital Italiano, CABA, Argentina. . Departamento de Neurología, Hospital Ita-  
2
3
4
liano, CABA, Argentina. .Servicio de Anatomía Patológica, Hospital Italiano, Argentina. .Instituto de Ciencia y Tecnología Ce-  
sar Milstein (ICTMilstein-CONICET), CABA, Argentina.  
Contacto: *P.R. Grigera, ICTMilstein-CONICET. Saladillo 2468, Ciudad de Buenos Aires(1440), Argentina(pgrigeracevan@  
centromilstein.org.ar).  
La ausencia y/o disfunción de 3 proteínas constitutivas del músculo, distrofina(UniProtKB - P11532) en  
Resumen  
el caso de las distrofinopatías y, disferlina(UniProtKB - O75923) y calpaina(UniProtKB - P20807) en las dis-  
trofias de cadera, juegan un papel central en la etiología de estas miopatías hereditarias. La confirmación  
de su presencia o ausencia en biopsias musculares es de relevancia diagnóstica y marca la necesidad de  
contar en el laboratorio clínico hospitalario con una técnica sensible y específica, que permita la detección  
e identificación de estas tres proteínas en nuestros de pacientes. El objetivo de este trabajo fue desarro-  
llar un protocolo de inmunoblot(Western blot, WB) adaptable al laboratorio de análisis clínicos hospitalario,  
para la detección de 3 proteínas constitutivas del musculo (distrofina, disferlina y calpaína 3) en material  
extraído de biopsias de pacientes. Aproximadamente 20 - 40 mg de biopsia muscular fue desnaturalizada  
en presencia de detergente SDS y mercaptoetanol por 10 minutos a 100°C y, posteriormente, analizadas  
en PAGE / SDS en formato mini-gel seguido de transferencia a membranas de nitrocelulosa e incubación  
con anticuerpos monoclonales(MAbs) con reactividad específica para las tres proteínas musculares men-  
cionadas y revelado cromogénico y/ o quimiolumínico. El protocolo presentado permite el análisis de un  
amplio rango de pesos moleculares que incluye a las 3 proteínas de interés: distrofina(430 Kd), disferli-  
na(250 Kd) y calpaína 3(95 Kd). La detección e identificación está basada tanto en la determinación del  
peso molecular relativo como en la reacción uníivoca con anticuerpos monoclonales específicos. En el caso  
de calpaína 3 la técnica es capaz de detectar e identificar fragmentos de auto procesamiento en el rango  
de 55 - 60 Kd, un dato indicativo, no sólo de la presencia y expresión del respectivo gen, sino también de la  
funcionalidad de su producto. Se discute la conveniencia de utilizar quimioluminiscencia o cromógenos en  
el revelado del WB.  
Palabras clave: distrofina, disferlina, calpaína 3, inmunoblot.  
The absence and/or dysfunction of three constitutive human muscle proteins: dystrophin (UniProtKB -  
P11532) in the case of dystrophinopathies, and calpain 3 and dysferlin (UniProtKB - P20807 and UniProtKB  
Abstract  
-
O75923, respectively), in limb-girdle muscular dystrophies or LGMD, play a key role in the etiology of these  
hereditary myopathies. Confirming their presence or absence in muscular biopsies is essential for a correct  
diagnosis of the disease and underlines the need for a sensitive and specific technique to detect these  
proteins in the clinical laboratory. To develop a Western blot protocol to be used in the clinical laboratory  
for the detection and identification of dystrophin, dysferlin and calpain 3 in muscle biopsies. Approximately  
2
0 - 50 mg of muscular biopsies in Urea and SDS containing buffer were analyzed in PAGE/SDS minigels,  
followed by electrotransference to nitrocellulose membranes, incubation with monoclonal antibodies  
MAbs) specific for each of the three mentioned proteins and development with either chromogenic or  
(
chemiluminescence reagents. We showed a protocol suitable for the analysis of the large molecular-weight  
proteins dystrophin (430 Kd), dysferlin (220 Kd) and calpain 3 (95 Kd). Identification was based on both  
ISSN 1515-6761 Ed. Impresa the analysis of their molecular weight and the univocal reactivity with specific monoclonal antibodies  
ISSN 2250-5903 Ed. CD-ROM  
Código Bibliográfico: RByPC  
(MAbs). In the case of calpain 3, the technique detects not only the 95 Kd complete gene product, but also  
Fecha de Recepción:  
extra polypeptides in the 55 - 60 Kd range, indicative of a functional protease. The convenience of either the  
chromogenic or chemiluminescence protocol for signal development is discussed.  
Keywords: dystrophin, dysferlin, calpain 3, westernblot.  
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4/02/2015  
Fecha de Aceptación:  
9/04/2016  
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ByPC 2016;80(2):28-33.  
Uso del inmunoblot(Western blot) en el laboratorio clínico para la detección de distrofina, disferlina y calpaína 3:  
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tres proteínas de relevancia en el diagnóstico de miopatías hereditarias.  
Introducción  
20 mM TrisHCl pH 6,8) con 5 - 10 golpes con tip descartable  
Las distrofias musculares(DM) son un grupo de miopa- en un tubo Eppendorf de 0,5 ml a 0 - 4 °C. A continuación,  
tías que afectan predominantemente al músculo estriado y se agregan 100 ul de Buffer Muestra 2X (40mM Tris pH 6.5,  
cuya etiología está asociada a la ausencia o disfuncionali- SDS 6 %, beta MSH 6 %, glicerol 50 %), seguido de vortex sua-  
dad de proteínas responsables de la arquitectura muscu- ve y desnaturalización a 98 °Cen bloque seco por 10 - 15 mi-  
1
,2  
lar . Entre los diferentes tipos de DMs se distinguen las nutos. Se clarificó por 15 minutos a 10 K.  
distrofinopatías de Duchenne o de Becker(DMD o BMD) y c) Sembrado y análisis electroforético de la muestra: de  
las distrofias musculares de cintura (limb-girdle muscular acuerdo con la experiencia realizada, el rango de material  
dystrophy o LGMD, de acuerdo a sus siglas en inglés) en sus sembrado oscila entre 15 - 20 ul, o sea aproximadamente  
formas dominantes: LGMD1 o recesivas LGMD2. Las distro- 10 - 20 % del total presente en los 150 ul finales(UPET +  
fias DMD / BDD se caracterizan por un déficit marcado de la BM) de tratamiento. La corrida se realiza a app 30 - 40 mA  
proteína distrofina, localizada en el sarcolema y parte de / 90 - 110 V por 3 - 4 horas en sistema mini gels de Bio Rad.  
un complejo proteico que conecta el citoesqueleto con la d) Transferencia: se realizó de acuerdo con protocolos es-  
3
8
tándares . Se utilizaron membranas de nitrocelulosa(20  
membrana basal .  
Por otro lado, las LGMD2 que tienen dos subtipos: A y B, um, Bio Rad) y las transferencias fueron hechas ON a 20  
están asociadas a la ausencia y / o disfunción de proteínas - 22 V/ 90 - 100 mA en buffer de corrida PAGE/SDS - 20 %  
claves en el mantenimiento y reparación de la estructura metanol. Las membranas fueron lavadas con H2O, previo a  
4
del músculo, como lo son la disferlina(LGMD2B) y la cal- la tinción con RojoPonceau y posteriormente bloqueadas  
paína 3, una proteasa con capacidad auto catalítica (LGM- con PBS/ BSA 3 % a temperatura ambiente por 1 hora, antes  
5
,6,7  
D2A)  
.
del agregado de la solución de anticuerpos.  
Como regla general, la ausencia de una proteína es debi- f) Detección con anticuerpos específicos y revelado: luego  
da, fundamentalmente, a defectos del gen que la codifica; del bloqueo se incuba la membrana por 2 horas a tempera-  
por lo tanto, verificar la presencia o ausencia de estas pro- tura ambiente o, también overnight a 4 °C con una dilución  
teínas en el músculo de pacientes con enfermedad miopá- de monoclonal (MAb) de ratón en dilución 1:100, para el  
tica hereditaria es de mayor importancia para un buen diag- caso de calpaina 3 y Disferlina y, 1:50 para el de distrofina  
nóstico y eventual tratamiento.  
en buffer PBS / Tween 0,1 %. En los tres casos la fuente co-  
8
El inmunoblot o Western blot,(WB) es una técnica am- mercial de los anticuerpos monoclonales(MAbs) utilizados  
pliamente utilizada en laboratorios de investigación acadé- es Novocastra-NC. Para distrofina: MAb NCL-DYS2-CE, para  
mica para la detección e identificación de proteínas presen- disferlina: MAb HAMLET-CE y para calpaína3: MAbs NCL-  
tes en muestras biológicas complejas. El WB tiene la ventaja CALP-2C4 y NCL-CALP - 12A2 . Luego de recuperar la solu-  
de proveer una doble, porque permite establecer el peso ción de anticuerpos (con 0,1 % Na Azida como conservante  
molecular relativo de proteínas y certificar su reactividad y mantenida a 4 °C para su reutilización por al menos 4 ci-  
con anticuerpos monoclonales de especificidad unívoca.  
clos), se hacen 3 lavados de 10 minutos c/u con 10 - 20 ml  
En este trabajo se muestran los resultados obtenidos en de PBS 1x / Tween 0,1 % seguido de incubación por 1 hora  
el desarrollo de un protocolo de WB, utilizable en el contexto a temperatura ambiente con dilución 1/2000 del conjugado  
del laboratorio clínico hospitalario y capaz de detectar cada peroxidasa anti ratón(Amersham) en el mismo buffer. Sigue  
una de las tres proteínas musculares mencionadas.  
el descarte de la solución con el conjugado, lavado de blot  
por 20 minutos con 20 ml de PBS/ T 0,1 % seguido por reve-  
10  
lado cromogénico con el substrato TMB o revelado quimio  
11  
Materiales y Métodos  
a) Análisis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes: lumínico(ECL, Amersham)  
.
se utilizaron geles de 8 % o 6 %(concentración final de Acri-  
lamida), en formato de mini gel (BioRad). Las soluciones Resultados  
y buffers son las descriptas originalmente para geles de  
Laemmli .  
La figura 1 muestra el perfil de WB obtenido en el análi-  
sis de 2 muestras representativas de biopsias musculares  
9
b) Procesamiento de las muestras: las muestras fueron independientes, provenientes de pacientes con diagnóstico  
provistas, en todos los casos, por el banco del Departa- negativo para enfermedad miotrófica hereditaria y utiliza-  
mento de Patología del Hospital Italiano de Buenos Aires, das como controles positivos. Las muestras fueron desna-  
siguiendo los protocolos establecidos para el manejo de turalizadas en buffer de Laemmli y corridas en minigeles 6  
muestras de este tipo, en el contexto clínico- hospitalario. % u 8 % PAGE/SDS, seguido de transferencia a nitrocelulosa,  
Muestras de Aproximadamente 50 - 70 mg se obtuvieron tinción con Rojo Ponceau e inmuno detección de acuerdo a  
de tacos de histopatología mantenidos a - 85 °C, lavados lo descripto en Materiales y Métodos.  
con buffer salino conteniendo EDTA 10 mM e inhibidores de  
El perfil de proteínas totales revelado por Rojo Ponceau  
proteasa(Halt™ protease inhibitor cocktail, Thermo). Las (paneles de la izquierda) confirma la presencia de 2 pro-  
muestras fueron disgregadas en 50 ul de buffer UPET (Urea teínas estructurales mayoritarias del músculo estriado,  
8
%, PMSF 5 mM, Protease inhibitor cocktail 1X, EDTA 10 mM, miosina(CAA86293, 210 Kd) y actina (P60709, 43 Kd) en  
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Uso del inmunoblot(Western blot) en el laboratorio clínico para la detección de distrofina, disferlina y calpaína 3:  
tres proteínas de relevancia en el diagnóstico de miopatías hereditarias.  
ambas muestras. La presencia de estas proteínas es indi-  
cativa de una buena solubilización del material proveniente  
de la biopsia muscular y de actividad proteolítica reducida o  
nula durante el procesamiento. El grado de tinción de miosi-  
na y actina, proporcional a sus concentraciones, es también  
referencia de normalización y permite comparar los niveles  
de las tres proteínas en estudio entre muestras diferentes.  
Diferencias en los niveles de recuperación de miosina entre  
experimentos y/o entre las diferentes muestras son espera-  
bles por la eventual acción proteolítica inespecífica durante  
el procesamiento y/o por variabilidad en la proporción entre  
material intersticial graso y proteínas estructurales mús-  
culo especificas en la preparación. Los 3 paneles: superior,  
medio e inferior en la derecha (figura 1) muestran el perfil  
de inmunoreactividad ante los anticuerpos monoclonales  
específicos, MAb Dys2, MAb Hamlet y MAb 2C4/12A2 para  
las proteínas distrofina, disferlina y calpaína 3, respectiva-  
mente.  
Figura I. Perfil de Inmunoblot de 2 muestras de biopsias  
de músculo revelado con quimioluminiscencia(ECL- Amer-  
sham).  
Como revelado se ha utilizado la técnica de quimiolumi-  
niscencia, que permite maximizar la sensibilidad y minimi-  
zar los riesgos de falsos negativos. Esto es particularmente  
importante en el caso la Distrofina, que constituye solo el  
0,002 % de la proteína total del músculo y cuya transferen-  
cia es relativamente ineficiente debido a su alto peso mo-  
lecular.  
El perfil mostrado en la figura 1 confirma que los anti-  
cuerpos monoclonales seleccionados son capaces de iden-  
tificar tres polipéptidos con los pesos moleculares espera-  
dos: distrofina(440 Kd), disferlina(250 Kd) y calpaina 3  
ꢀ
Las muestras se corrieron en minigeles PAGE/SDS 6 % (para análisis  
de distrofina) y 8 % (para análisis de disferlina y calpaína 3). Los  
anticuerpos monoclonales(MAbs) utilizados son: para distrofina:  
MAb NCL-DYS2-CE, para disferlina: MAb HAMLET-CE y para calpaína  
3: mezcla equivalente de MAbs NCL-CALP-2C4 y NCL-CALP-12A2.  
El panel superior derecho muestra la presencia de distrofina y una  
isoforma minoritaria de menor peso molecular que es posiblemente  
producto de degradación parcial (marcada con cabeza de flecha). El  
panel central derecho muestra el perfil obtenido con anti disferlina.  
Se puede detectar además una banda minoritaria de app. 70 Kd, pro-  
ducto posiblemente de deleción (cabeza de flecha). En el caso de  
calpaína 3, panel inferior, se detectan además de una banda con el  
peso molecular de 95Kd, el esperado para la molécula completa de  
calpaína 3, tres polipéptidos en la región de 50 - 60 Kd originados por  
auto proteólisis. La sobre exposición muestra también un efecto de  
masa inespecífico del revelado de la miosina, señalada por la cabeza  
de flecha. La barras sobre la izquierda indican la posición relativa de  
los markers de 250, 150, 100 y 75 Kds en orden descendente y tam-  
bién es señalada la posición de actina( 43 Kd).  
(95 Kd), en ambas preparaciones testigos. En el caso de la  
distrofina(panel superior) la sensibilidad del método permi-  
te también detectar bandas reactivas de menor peso mole-  
cular(250 - 350 Kd), que pueden ser isoformas endógenas  
y/o productos de degradación parcial. El panel intermedio  
muestra el perfil obtenido con anticuerpos anti disferlina.  
Es clara aquí la presencia de un polipéptido de 250 Kd, co-  
rrespondiente a la molécula entera de disferlina, así tam-  
bién, como de una banda minoritaria y de aproximadamente  
7
0 Kd (señalada en la figura), originada posiblemente por  
6,7  
proteólisis inespecífica  
.
En el caso de la calpaína 3, una proteasa calcio-depen-  
diente de importancia en el remodelado de la estructura  
muscular4 , la mezcla de 2 anticuerpos monoclonales  
específicos detecta, tanto al polipéptido de 95 -100 Kd co-  
rrespondiente a la molécula completa de la proteasa, como  
a fragmentos de auto procesamiento que corren con pesos  
de la utilización de films radiográficos ni revelado en cuarto  
oscuro, simplificando el proceso de detección, por lo tanto  
constituye una alternativa válida para laboratorios clínicos  
de menor complejidad. El revelado muestra la casi exclusiva  
presencia de un polipéptido con el peso molecular esperado  
para Disferlina en 4 de las 5 muestras. La disferlina no fue  
detectada en la muestra analizada en la calle 3, un resulta-  
do compatible con el diagnóstico clínico de disferlinopatía  
correspondiente al paciente del cual fue obtenida. La tinción  
con Rojo Ponceau en el panel de la izquierda confirma la pre-  
sencia de miosina y actina en las 5 preparaciones e indi-  
ca que el material ha sido extraído en forma satisfactoria y  
minimizando artefactos de proteólisis. La figura 2B, a modo  
de comparación, muestra un análisis independiente de 7  
,12  
6
moleculares relativos de 61 y 55 Kd . Este perfil es compati-  
ble con la información bibliográfica y es indicativo no solo de  
expresión del gen de calpaína 3, sino también de la presen-  
5
,6,7  
cia de una proteasa activa y funcional en el músculo  
.
En la figura 2A se muestra el perfil de WB obtenido con  
el MAb anti disferlina bajo idénticas condiciones de proce-  
samiento y análisis previos, pero revelado con reactivo  
cromogénico TMB. Esta técnica de revelado tiene menor  
sensibilidad que la quimioluminiscencia, pero no requiere  
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Uso del inmunoblot(Western blot) en el laboratorio clínico para la detección de distrofina, disferlina y calpaína 3:  
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tres proteínas de relevancia en el diagnóstico de miopatías hereditarias.  
preparaciones, pero revelado con reactivo quimio lumínico,  
Figura II. A) Perfil de disferlina y revelado cromogénico.  
c
B) Revelado por quimioluminiscencia.  
Figura III. Perfil con MAbs anti calpaína 3. A) Revelado  
cromogénico y B) Revelado por quimioluminiscencia.  
ꢀ
A) Perfil de disferlina y revelado cromogénico. Cinco muestra de biop-  
sias independientes fueron analizadas en gel 8 % PAGE/SDS, transferi-  
das a nitrocelulosa incubadas con anticuerpo MAb Hamlet seguido de  
revelado cromogénico con TBS. Cuatro de las 5 muestras (calles 2, 3, 4  
y 5) muestran presencia de disferlina mientras que en la muestra de la  
calle 1 no se detecta presencia de la proteína. Las bandas de miosina ꢀPerfil con MAbs anti calpaína 3. A) Revelado cromogénico: 5  
(
Mio) en el panel superior izquierdo visualizada con Rojo Ponceau son  
muestras representativas fueron analizadas en geles PAGE/DSD 8  
%, transferidas y probadas con la mezcla de anticuerpos monoclo-  
nales, NCL-CALP-2C4, NCL-CALP-12A2 específicos para calpaina-3.  
El revelado fue hecho con reactivo cromogénico TMB posterior a la  
tinción con Rojo Ponceau (panel izquierdo). Las tres flechas seña-  
lan a polipéptidos de 60, 58 y 55 Kd originados por autoproteólisis  
del polipéptido de 95 Kd, correspondiente a la molécula completa  
de calpaína 3. B) Revelado por quimioluminiscencia: una alícuota  
de la muestra analizada en la calle 1 de la Figura 3A, fue corrida en  
paralelo con muestras controles (calles 2 y 3), seguido por trans-  
ferencia, tinción con Rojo Ponceau y revelado por quimioluminis-  
cencia. El resultado confirma la ausencia de señal para calpaina  
utilizadas como referencia y normalización de la siembra de material.  
Los markers (calle M) corresponden a 250, 150, 100, 75 y 40 Kd en  
orden descendente. B) Revelado por quimioluminiscencia. Siete pre-  
paraciones independientes se analizaron con MAb HAMLET bajo idén-  
ticas condiciones a las descriptas en el análisis de la figura 2A, salvo  
que el revelado fue hecho por quimioluminiscencia. Las calles 2 y 5  
muestran ausencia de señal para disferlina en las muestras mientras  
que la tinción con Rojo Ponceau confirma que hay sembradas canti-  
dades equivalentes de material en todas las calles. Los markers (M)  
corresponden a 180, 130, 95, 72, 55 y 43 Kd en orden descendente.  
3
y/o los polipéptidos originados por auto proteósis en la muestra  
analizada en calle 1. Los pesos moleculares relativos de los mark-  
ers (M) señalados por barras en la figura son 250, 150, 100, 75,  
tectada en las preparaciones analizadas en las calles 2 y  
, pese a que el perfil de Rojo Ponceau deja en claro que la  
carga de las muestras, la distribución y la calidad de las pro-  
teínas totales, es similar en todas las preparaciones.  
5
55 y 40 Kd en orden descendente.  
La figura 3A muestra el perfil de Rojo Ponceau (panel nea en la región de 60 - 50 Kd. La tinción con Ponceau indica  
izquierdo) y de inmuno reactividad (panel derecho), de alí- que la cantidad de material total sembrado en la calle 1 es  
cuotas provenientes de las mismas preparaciones analiza- similar a la de las otras muestras y la presencia de miosina  
das en la figura 2, pero enfrentadas con una combinación de y actina sugieren un procesamiento libre de artefactos de  
2
anticuerpos específicos, NCL-CALP-2C4 y NCL-CALP-12A2, proteólisis. Se concluye, que la ausencia de calpaína 3 bajo  
contra calpaína 3. El revelado con reactivo cromogénico estas circunstancias no es un artefacto del procesamiento  
TMB muestra un polipéptido de 95 Kd correspondiente a la sino la consecuencia de su falta de expresión y/o un exacer-  
proteasa completa, en 2 de las 5 preparaciones (CALP3 en bado proceso de proteólisis intracelular.  
calles 3 y 5). En cuatro muestras independientes (calles 2,  
En la figura 3B se ha corrido una nueva alícuota de esta  
3, 4 y 5) también se pudo detectar la presencia de polipép- preparación (calle 1) en paralelo con otras 2 muestras de  
tidos reactivos en la zona de 50 - 60 Kd del gel, que como se pacientes asintomáticos para LGMD2A (calles 2 y 3), pero el  
mencionó(figura 1) se originan en la autoproteólisis de cal- revelado ha sido hecho, esta vez, por quimioluminiscencia.  
paína 3 (95 Kd) y son indicativos de una enzima presente y Bajo estas condiciones, de mayor sensibilidad, tampoco  
activa. Es interesante destacar que la preparación analiza- se pudo detectar la presencia de polipéptido de 95 Kd ni de  
da en la calle 1 muestra niveles casi inexistentes del poli- fragmentos de auto proteólisis. Es digno de destacar que la  
péptido de 95 Kd y muy disminuídos en la banda heterogé- preparación analizada en la calle 1 proviene de un pacien-  
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Uso del inmunoblot(Western blot) en el laboratorio clínico para la detección de distrofina, disferlina y calpaína 3:  
tres proteínas de relevancia en el diagnóstico de miopatías hereditarias.  
te sospechado de LGMD2A y la ausencia de polipéptidos de co es una alternativa válida a la quimioluminiscencia. En to-  
5 Kd y derivados en la zona 60 - 50 Kd descripta aquí es dos los casos el perfil de Rojo Ponceau y en especial el de las  
9
compatible con ese diagnóstico. El WB, en la figura 3B, tam- proteínas constitutivas miosina y actina, permite la norma-  
bién muestra bandas sobreexpuestas de disferlina (señala- lización intermuestras y descartar artefactos proteolíticos.  
das por cabeza de flecha) en todas las calles debido al pre  
El caso de calpaína 3, una proteína no estructural con  
tratamiento de la membrana con anticuerpo anti Disferlina, capacidad auto catalítico y esencial para el mantenimien-  
5
,6,7  
que confirma la presencia de la proteína en las 3 muestras. to de la arquitectura de la célula muscular , merece  
Tomados en conjunto estos resultados muestran que am- especial consideración. Debido a la falta de mutaciones  
1
5
bos, el revelado cromogénico y la quimioluminiscencia son sobresalientes(“hot spots”) la interpretación de los aná-  
alternativas válidas para detectar disferlina y, eventual- lisis de secuencia del gen CPN3, que codifica para calpaína  
mente calpaína 3 en el contexto del laboratorio clínico. La 3, presenta significativa complejidad y las técnicas de in-  
quimioluminiscencia, por otro lado, es la técnica de revelado munohistoquímica con los anticuerpos anti calpaína dispo-  
de elección para el caso de la distrofina como se muestra en nibles suelen no ser concluyentes. El WB es por lo tanto la  
la figura 1.  
forma más sencilla para constatar o descartar su presen-  
cia en músculo de pacientes  
La ventaja del WB es que permite detectar no sólo a la  
16.  
Discusión  
8
El inmunoblot o WB permite la identificación de proteí- proteasa completa de 95 Kd sino también a sus fragmen-  
nas en base a la reacción entre un anticuerpo especÍfico tos de auto proteólisis. La presencia de estos últimos confir-  
en solución con un antígeno proteico electro transferido a ma la existencia de una calpaína 3 funcional, un aspecto de  
un soporte de nitrocelulosa posterior a su separación elec- mayor importancia al momento de correlacionar la clínica  
troforética en geles PAGE/SDS. Esta técnica, ampliamente con los resultados de laboratorio. Como se muestra en las  
utilizada en laboratorios de investigación básica, para iden- figuras 1 y 3 ambas estrategias de revelado (quimioluminis-  
tificar proteínas en mezclas biológicas complejas ha sido cencia y cromogénica) permiten detectar una proteína de  
transferida a laboratorios de análisis clínicos para ser usada 95 Kd correspondiente a la molécula de calpaína 3 entera  
principalmente en la detección del virus de la inmunodefi- así como también 3 polipéptidos producto de auto proteóli-  
6
ciencia humana (HIV) en suero de pacientes. En este forma- sis, que migran en la zona de 56 y 60 Kd . En las calles 1  
to, los anticuerpos séricos anti HIV, la variable a determinar, a 5 del gel de figura 3A se resumen los 3 tipos de perfiles  
son enfrentados a preparaciones purificadas de antígeno esperables en cualquier muestra analizada con MAbs 2C4 y  
6
,7  
viral fijados al soporte membranoso. La técnica así utilizada 12 A2 anti calpaína 3 . En el perfil mostrado en las calles  
requiere un cuidadoso análisis de interpretación de resulta- 3 y 5, se distingue la presencia de calpaína 3 (95 Kd) y una  
dos debido a problemas de sensibilidad y potenciales fal- proporción variable de fragmentos de auto proteólisis de 61  
sos positivos1 . Por el contrario, el protocolo de WB pro- y 55 Kds. En el segundo tipo (representado en las calles 2 y  
puesto aquí es utilizado para identificar tres proteínas con 4) las cantidades de calpaína 3 (95 Kd) son mínimas pero  
secuencia y pesos moleculares conocidos con antelación hay cantidades bien definidas de polipéptidos derivados  
y utilizando anticuerpos monoclonales, cuya especificidad en la zona de 50 - 60 Kd. Y en el tercero los niveles de am-  
3,14  
6
,7  
está estrictamente pre-definida (figura 1).  
bas especies son apenas detectables, aun utilizando qui-  
El revelado por quimioluminiscencia posee una sensi- mioluminiscencia (calle 1, figuras 3A y 3B. La proporción  
bilidad de 1 - 5 ng, un orden de magnitud superior que el entre la cantidad de calpaína 3 (95 Kd) y de polipéptidos  
método cromogénico. Esto es de particular importancia en de 55 - 60 Kd puede servir como estimación del grado de  
el caso de la distrofina, una proteína de alto peso molecu- actividad proteolítica en la célula muscular, aunque esta  
lar que constituye sólo el 0,002 % de la proteína total del interpretación está condicionada a la minimización de arte-  
músculo. Debido a su tamaño, la relación moles a masa de factos de proteólisis durante procesamiento de la muestra.  
la distrofina es significativamente menor al de las otras dos En ese aspecto, especial cuidado debe ponerse en garanti-  
proteínas analizadas aquí, y por lo tanto, es la de menor zar la cadena de frío para el manejo de la muestra desde el  
carga especifica de anticuerpos(moléculas de Mab por ug preciso momento de su obtención. De mayor importancia  
de proteína) de las tres. Dada la cantidad de muestra anali- también es la utilización de inhibidores de proteólisis así  
zada (equivalente a 20 mg de biopsia) y a la baja eficiencia como realizar una rápida solubilización y desnaturalización  
de la transferencia para proteínas de 400 Kd, es esperable de la biopsia muscular en presencia de Urea y detergente  
que los niveles de distrofina, efectivamente presentes en la SDS previo a su análisis en PAGE/SDS. Como se mencionó,  
membrana estén por abajo del límite de detección del reve- el perfil de tinción con Rojo Ponceau del material bloteado  
lado cromogénico. Esto hace necesario el revelado con qui- en la membrana y la confirmación de integridad de las pro-  
mioluminiscencia sobre el reactivo cromogénico TMB para el teínas miosina y actina son aspectos de mayor relevancia  
caso de distrofina(resultados no mostrados).  
para una correcta evaluación de las cantidades relativas  
El perfil mostrado en la figura 2A por otro lado, confirma de las tres proteínas y su normalización intermuestras. En  
que en el caso de disferlina (250 Kd) el revelado cromogéni- síntesis, los perfiles obtenidos en el análisis por WB de 3  
ByPC 2016;80(2):28-33.  
Uso del inmunoblot(Western blot) en el laboratorio clínico para la detección de distrofina, disferlina y calpaína 3:  
33  
tres proteínas de relevancia en el diagnóstico de miopatías hereditarias.  
proteínas claves en la estructura y función muscular son 14. Centers for Disease Control and Prevention. Inter-  
los esperables tanto por las características de las muestras  
como por la especificidad de los anticuerpos monoclonales  
validados académica y comercialmente. La puesta a punto  
de esta técnica es a nuestro entender un valioso ejemplo de  
pretation and Use of the Western Blot Assay for Se-  
rodiagnosis of Human Immunodeficiency Virus Type  
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boratorio de investigación al laboratorio de análisis clínicos  
y una contribución al aumento en la calidad y diversidad de  
los recursos diagnósticos en la institución hospitalaria.  
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