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El silenciamiento génico  
REVISIÓN  
El silenciamiento génico  
Sánchez, Mercedes Leonor1  
Laboratorio Inmunomoduladores en Transplantes e Infecciones, Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos CEFYBO,  
Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires. Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.  
Contacto: Sánchez, Mercedes Leonor;  
mercedessanchez57@yahoo.com.ar; mercedes.sanchez@conicet.gov.ar  
Resumen  
En la célula existen muchas formas de regular la expresión génica. Una de ellas es por medio del  
silenciamiento génico, que constituye un mecanismo celular mediante el cual se inhibe la expresión  
de genes, controlando la expresión de genes endógenos y exógenos. Este representa un papel impor-  
tante en la regulación del desarrollo, en la diferenciación celular y en la defensa contra secuencias  
de organismos invasores y transposones. Tiene lugar tanto en el núcleo como en el citoplasma de la  
célula y puede participar en la regulación de la etapa de transcripción y de traducción. El ARN doble  
hebra suele ser la señal de activación del mecanismo de silenciamiento génico. Hasta el momento se  
ha demostrado que el silenciamiento génico ocurre en plantas, algas unicelulares, hongos, nematodos  
(Caenorhabditis elegans), la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) y en células de mamíferos.  
Su utilidad en biotecnología y medicina ha sido ampliamente desarrollada. El ARN de interferencia se  
ha convertido en una herramienta de experimentación para la caracterización funcional de genes en  
el laboratorio y en muchas áreas de investigación científica. La siguiente revisión incluye información  
acerca del desarrollo de estrategias para la aplicación del ARN de interferencia en organismos vivos y  
su aplicación en la terapéutica.  
Palabras clave. Silenciamiento de genes, ARN de interferencia, ARNi, ARNsi, ARN pequeño de horquilla,  
ARNsh.  
Gene expression in the cell is regulated by many different ways. One is through gene silencing,  
which constitutes a cellular mechanism by which the expression of genes is inhibited, controlling  
the expression of endogenous and exogenous genes. This mechanism plays an important role in  
the regulation of development, cell differentiation and defense against sequences from invading  
organisms and transposons. It takes place both in the nucleus and in the cytoplasm and participates  
in the regulation of transcription and translation. The signal of activation of gene silencing is often  
double-stranded RNA. So far, gene silencing has been shown to occur in plants, single-cell algae, fungi,  
nematodes (Caenorhabditis elegans), fruit fly (Drosophila melanogaster) and mammalian cells. Its  
usefulness in biotechnology and medicine has been widely studied. Interference RNA has become an  
experimentation tool for the functional characterization of genes in the laboratory and in many areas  
of scientific research. The following review includes information on the development of strategies for  
the application of interfering RNA in living organisms and their application in therapeutics.  
Abstract  
Key words. Gene silencing, interference RNA, small interference RNA, siRNA, small hairpin RNA, shRNA.  
ISSN 1515-6761 Ed. Impresa  
ISSN 2250-5903 Ed. CD-ROM  
Código Bibliográfico: RByPC  
Fecha de recepción:  
6
/05/2017  
Fecha de aceptación:  
9/08/2017  
2
ByPC 2017;81(3):41-51.  
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Introducción  
específicos de la secuencia y fue el primero en demostrar  
El silenciamiento por ARN es un mecanismo altamente con- su utilidad para inhibir la expresión génica humana. Estos  
servado en la naturaleza, en el que moléculas de ARN de doble ARNsi se procesan a partir de precursores de ARN de doble  
hebra (del inglés “double strand RNA o dsRNA”) regulan la ex- cadena más largos y se ensamblan en complejos efectores  
presión de genes.  
El fenómeno fue inicialmente descubierto en 1990, cuan- complementarios a una de las cadenas de ARNsi.  
do los botánicos Napoli, Lemieux y Jorgensen, trabajando en Se han descrito varias clases de moléculas pequeñas de  
que desestabilizan ARN mensajeros, parcial o totalmente  
Oakland, California, introdujeron varias copias del gen que ARN que desencadenan el proceso de silenciamiento por in-  
codifica para una enzima, que produce el color púrpura en las terferencia. Existen tres tipos de ARN pequeños que pueden  
petunias, describiendo que se generaban flores sin color o con silenciar el ARNm en el citoplasma (8,9): los piwi-ARNs (piR-  
parches blancos (1). Los niveles de la enzima eran 50 veces NAs), los microARN (miRNAs), y los ARNsi (siRNAs).  
menores que los de las plantas originales. Los genes que intro-  
Los microARN (en inglés, micro-RNA o miRNA) son peque-  
dujeron no se estaban expresando y el gen natural de la planta ños ARN interferentes que se generan a partir de precurso-  
dejaba de expresarse, razón por la cual al fenómeno se lo llamó res específicos codificados en el genoma, que al transcribir-  
co-supresión.  
se se pliegan en horquillas (hairpins) intramoleculares, las  
En 1992 Romano, Macino y Quelling, trabajando en Roma, que contienen segmentos de complementariedad imper-  
Italia, describieron un fenómeno equivalente en un hongo co- fecta. El procesamiento de los precursores ocurre general-  
nocido como Neurospora crassa (2). Y en 1998, en Baltimore, mente en dos etapas, catalizado por dos enzimas, Drosha  
Maryland, Fire, Xu, Montgomery, Kostas, Driver y Mello des- en el núcleo y Dicer en el citoplasma. Como ocurre con los  
cubrieron que tras la inyección de ARN de doble hebra dentro siRNA, una de las hebras del miRNA (la hebra antisentido),  
del nematodo Caenorhabditis elegans se producía un silencia- se incorpora a un complejo similar al RISC. Dependiendo del  
miento de la expresión de genes que era específico de secuen- grado de complementariedad del miARN con el ARNm, los  
cia, y fue denominado interferencia de ARN o ARNi (RNA Interfe- miARN pueden bien, inhibir la traducción del ARNm o bien  
rence RNAi) (3). Andrew Fire y Craig Mello recibieron el premio inducir su degradación. Sin embargo, a diferencia de la vía  
Nobel de Medicina en el 2006.  
de los ARNsi, la degradación de ARNm mediada por miARN  
Un transposón o elemento genético transponible es una se inicia con la eliminación enzimática de la cola de poli(A)  
secuencia de ADN que puede moverse de manera autosufi- del ARNm (10). Estos microARNs están involucrados en mu-  
ciente a diferentes partes del genoma de una célula, un fe- chos procesos biológicos e incluso se expresan en virus (en  
nómeno conocido como transposición. En este proceso, se particular, miembros de la familia herpesvirus) controlando  
pueden ocasionar mutaciones y cambios en la cantidad de la estabilidad del ARN mensajero y la traducción de cientos  
ADN del genoma. La trasposición implica que un segmento de dianas del ARN mensajero.  
de ADN se mueve directamente de una posición a otra en el  
genoma, usando una enzima transposasa para cortar y pe- croRNA están codificados en el genoma de la célula.  
garse. A diferencia de los provirus, los transposones se inte- Los piRNAs (11,13) son pequeños ARN no codificantes de  
Los ARNsi tienen origen exógeno mientras que los mi-  
gran en el ADN celular en lugares bien determinados. Barba- 21-24 nucleótidos de longitud, que regulan principalmente  
ra McClintock recibió el Premio Nobel de Medicina en 1983 la actividad del transposón en el desarrollo de la línea ger-  
por haber propuesto su existencia en el maíz. Su presencia minal al unirse a proteínas Piwi, un subconjunto de la clase  
en bacterias no se demostró hasta mucho más tarde.  
Argonauta de proteínas. Los piRNAs se expresan específica-  
Hasta el año 2000, el ARNi se utilizó como herramienta mente en células de línea germinal de hembras y machos  
para apagar la expresión de genes en varios organismos. En y son necesarios para el desarrollo normal de células ger-  
mamíferos, se observó que las moléculas grandes de ARN minales. La eliminación de los genes piwi en ratones causa  
de doble hebra (de más de 30 pares de bases) inducen una infertilidad masculina. Los esfuerzos para caracterizar su  
respuesta que generalmente desencadena la muerte de biogénesis están en curso, pero se ven obstaculizados por  
la célula. Sin embargo, posteriormente, Elbashir, Harborth, la falta de líneas celulares que expresan piRNAs.  
Lendeckel, Yalcin, Weber y Tuschl describieron que cuando  
se utilizan directamente los ARN pequeños de interferencia do a la hebra molde del ARNsi puede llevar a cabo silencia-  
ARNsi, del inglés “small interference RNA o siRNA”), es posi- miento génico a nivel del núcleo, puesto que logra entrar en  
Posteriormente se descubrió que el complejo RISC uni-  
(
ble inducir el proceso de interferencia en células de mamífe- el mismo, reconocer secuencias específicas del genoma  
ro, sin que se despierte la respuesta que conduce a la muer- y alterar el patrón de metilación del ADN y de las histonas  
te celular (4-7). Este descubrimiento abrió la posibilidad de provocando el silenciamiento del gen antes de que llegue,  
utilizar la interferencia de ARN como una herramienta en la incluso, a transcribirse.  
investigación enfocada a células de mamíferos.  
Al tratarse de un mecanismo de regulación génica, el  
El Dr. Tuschl caracterizó molecularmente los pequeños ARNi tiene un papel clave en los procesos de desarrollo y  
ARNsi, una clase de moléculas bicatenarias de 21 nucleó- diferenciación celular, en situaciones patológicas como el  
tidos de longitud que guían el silenciamiento de genes cáncer y en defensa frente a virus.  
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Mecanismos de silenciamiento génico  
El mecanismo de la ARNi fue explicado in vitro utilizando gen que está siendo “silenciado”.  
como modelo la mosca de la fruta Drosophila melanogaster Otro fenómeno importante que ocurre en varios organis-  
11). Estos estudios revelaron que moléculas largas de ARN mos, pero no en mamíferos, es que los mediadores de la inter-  
secuencia. En este caso tampoco habrá síntesis proteica del  
(
de doble hebra eran cortadas en fragmentos pequeños con ferencia pueden viajar desde las células en que se producen  
una estructura específica: dos hebras de 21 a 25 nucleótidos hasta otras células del organismo. De esta manera es posible  
interaccionando en forma de dúplex, donde 19 nucleótidos se lograr que se silencie la expresión de un gen en el organismo  
encuentran formando ARN de doble hebra con dos nucleóti- completo, aunque la inducción original haya sido solamente  
dos sin aparearse en los extremos.  
en una parte. En este tipo de organismos, como el gusano C.  
Los ARNsi son producidos a partir de precursores de ARN elegans, el silenciamiento es heredable.  
de doble hebra, que varían de tamaño y origen. Estos precur-  
El mecanismo de interferencia está presente en todos los  
sores son procesados por miembros de la familia de enzimas eucariotas en los que se ha buscado; esto sugiere que es un  
que degradan al ARN, conocidas como la familia de la ARNasa mecanismo muy antiguo que apareció temprano en la evolu-  
tipo III. En particular, la enzima que genera los ARNsi se co- ción y que tiene un papel importante en el mantenimiento del  
noce como Dicer. Estos ARNs resultantes son incorporados a funcionamiento celular.  
un complejo denominado complejo de silenciamiento induci-  
Una de las principales estrategias utilizadas en la investi-  
do por el ARN o RISC (RNA-induced silencing complex) (12). gación científica para el estudio de los distintos mecanismos  
Este complejo está compuesto por numerosas proteínas celulares se denomina “pérdida de función”. Este concepto se  
celulares. La incorporación del ARNsi al RISC está acoplada a refiere a la eliminación específica de la función de una proteí-  
la separación de las dos hebras en cadenas simples, una de na en la célula, para después evaluar los cambios y así definir  
las cuales, conocida como hebra guía, se mantiene asociada el papel que juega dicha proteína. Por ejemplo, si se tratara  
al complejo y sirve para identificar al ARN mensajero blanco de una proteína que se requiere para promover la replicación  
con el cual se va a complementar. Cuando las moléculas de celular, al anular su función se encontraría que las células ya  
ARN complementarias hibridan, la interacción entre el ARNsi no se replican. Esta estrategia ha sido extensamente utiliza-  
y este ARNm determina su corte y posterior degradación. La da desde hace tiempo. La anulación de la función se puede  
hebra guía del ARNsi y el ARNm blanco deben presentar una realizar de varias maneras.  
perfecta complementariedad cerca del sitio de rompimiento  
o ruptura, el cual se sitúa a 10-11 nucleótidos del extremo 5’ disminución en la expresión de un gen mediante ARNi. Una  
del ARNsi (13). segunda técnica es lo que denominamos “noquear el gen”  
Knock down es una expresión en inglés que indica una  
Se trata de un mecanismo específico ya que el silencia- (knock-out, KO), en este caso el gen se elimina del genoma  
miento génico se basa en la complementariedad de bases y por lo tanto la proteína de interés ya no es expresada en la  
entre la molécula de ARNsi y la molécula de ARN mensajero. célula. Estas estrategias requieren modificar la información  
Si la complementariedad de bases es perfecta se producirá la a nivel del ADN, es decir, del gen. Regularmente estos enfo-  
hidrólisis del mensajero mientras que, si no lo es, simplemen- ques requieren de entrenamiento especializado y de mucho  
te se inhibirá la traducción al impedir la unión del ribosoma.  
La represión de la expresión de los genes mediante el si-  
trabajo.  
Dentro de las estrategias para el uso efectivo de la inter-  
lenciamiento génico puede ocurrir a dos niveles: transcripcio- ferencia de ARN se pueden considerar dos tipos de ensayos:  
nal y post-transcripcional. los transitorios, donde la expresión del gen se interfiere sólo  
El silenciamiento génico transcripcional (Transcriptional temporalmente y los estables en los cuales las células o el  
Gene Silencing, TGS) tiene lugar en el núcleo de la célula. Me- organismo son permanentemente interferidos.  
diante el TGS se inhibe la síntesis de ARNm, es decir, no ocurre  
En el knock down la inhibición del gen no es total, esto se  
la transcripción. En este caso, los genes están silenciados por diferencia del knock out donde el gen es eliminado completa-  
modificaciones como el reordenamiento del ADN, y la modifi- mente del genoma.  
cación química de las histonas como la adición de un grupo  
En el primer caso suelen utilizarse los ARNsi sintetizados  
metilo (-CH3). Todos estos mecanismos pueden inducir a la químicamente; para el segundo, se requiere que la célula in-  
formación de heterocromatina, es decir, se constituyen en corpore a su genoma los elementos necesarios para fabricar  
zonas de ADN de alta densidad que impiden el acceso de la una molécula de ARN de doble hebra que llegue hasta el cito-  
“
maquinaria transcripcional” y que, por ende, los genes que plasma.  
se encuentran en esa región, no se expresan. En plantas, los La interferencia de ARN ha demostrado su enorme poten-  
ARNsi pueden ser transportados al núcleo e inhibir la síntesis cial, lo que se refleja en el creciente número de artículos cien-  
del ARNm del gen correspondiente.  
tíficos que la refieren como estrategia experimental.  
En cambio, en el silenciamiento génico postranscripcional  
(Post-Transcriptional Gene Silencing, PTGS) hay transcrip- Síntesis de ARNsi  
ción del gen silenciado. Lo que ocurre es que el ARNm sin-  
La síntesis de los ARNsi puede hacerse por varias vías. En  
tetizado es degradado de forma específica, en función de su el caso de plantas e invertebrados, se pueden utilizar molé-  
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culas grandes de ARN de doble cadena, que serán procesa- dos usando reactivos basados en lípidos catiónicos o polia-  
das a ARNsi dentro de la célula. En este trabajo se habla de minas (RNAiFect de Qiagen, Oligofectamine de Invitrogen, si-  
ARN pequeño de horquilla o ARNsh, por lo tanto es necesario PORT NeoFX de Ambion). Este método es eficiente en el caso  
hacer una aclaración sobre esta terminología.  
de células inmortalizadas adherentes, pero no para células  
Hairpin (horquilla) es una estructura que presenta el ADN en suspensión y recién purificadas (cultivos primarios). El  
o el ARN cuando una hebra con secuencias de nucleótidos método de elección en este último caso es la electropora-  
repetidas e invertidas se dobla sobre sí misma y forma una ción (electroporation), la cual consiste en la apertura de  
estructura de doble hebra con las secuencias invertidas, poros en la membrana celular, mediante la aplicación de  
ahora complementarias y un doblez en forma de “bucle” en pulsos eléctricos. Este procedimiento puede comprometer  
un extremo. Esta se conoce en inglés como hairpin.  
severamente la viabilidad celular y se recomienda optimizar  
En vertebrados es necesario utilizar directamente mo- las condiciones del procedimiento, para evitar un alto grado  
léculas de ARNsi o bien ARN pequeños de horquilla (short de muerte celular. Por lo general, esto se logra siguiendo las  
hairpin RNA o ARNsh). La fuente más común es la síntesis recomendaciones de las compañías que ofrecen los apara-  
química del ARN de doble hebra.  
tos y/o amortiguadores para electroporación.  
Los ARNsi son sintetizados y usados fácilmente (14). La  
Otra alternativa a la lipofección es el uso de vectores de  
desventaja es el corto tiempo de duración del silenciamien- origen viral que permitan introducir el ARNsh a la célula blanco.  
to y que no resulta fácil introducirlos en células como los A diferencia de la transfección, con un vector viral es po-  
cultivos primarios. Pueden ser el método de elección ya que sible alcanzar eficiencias del 100 % (infectar todas las cé-  
la mayoría de los experimentos son completados en tres a lulas). Se han desarrollado varios vectores virales, en par-  
siete días. Este período depende del grado de proliferación ticular derivados de adenovirus, retrovirus y lentivirus. Una  
de la célula blanco, cuanto mayor sea el nivel de prolifera- segunda ventaja de los vectores virales es que permiten ser  
ción, el “silenciamiento” durará menos tiempo.  
utilizados en organismos completos, lo cual es indispensa-  
ble cuando se piensa en el potencial terapéutico del meca-  
nismo de interferencia del ARN.  
Vectores de introducción del ARN en la célula  
Si lo que se desea es utilizar ARNsh o miARN, entonces  
Para incrementar la duración del silenciamiento por ARNi  
hay que seguir otra estrategia. Primero hay que fabricar un se desarrollaron vectores de expresión que contienen pro-  
fragmento de ADN a partir del cual se logre sintetizar el ARN- motores de la ARN polimerasa, para la trascripción de ARNsi  
sh o el miARN. Para poder introducirlo en la célula y que pue- dentro de la propia célula. Los vectores de expresión son  
da producirse a partir de la maquinaria celular, se requiere derivados plasmídicos o de virus que son introducidos a las  
de un vector que generalmente será un plásmido diseñado células de manera estable y son transmitidos a través de  
para este propósito.  
varias generaciones.  
Una de las ventajas de ésta estrategia es que se consi-  
Los elementos importantes de un vector de expresión  
gue seleccionar las células en las cuales el vector se integre son: el tipo de promotor (que permite expresarlo en proca-  
al genoma de la célula; en este caso todas las células hijas riotas o en eucariotas), un sitio de inserción (clonado) de  
tendrán integrado el vector y, por lo tanto, dicha población los ARN pequeños, presencia de marcadores (por ejemplo,  
de células estará permanentemente silenciada.  
la proteína verde fluorescente o GFP Green fluorescence  
Otro elemento importante a considerar es el mecanismo protein) o bien genes de resistencia a antibióticos (por  
para introducir el ARNsi. Aquí también hay diferencias funda- ejemplo, la neomicina), que permitan la selección de las cé-  
mentales entre organismos. Por ejemplo, en insectos es posi- lulas blanco que contengan el vector. En algunos casos, se  
ble simplemente sumergir al organismo en una solución con puede utilizar un sistema denominado condicionado o indu-  
el ARN de doble hebra y este penetrará en la célula, porque cible en el cual el vector contiene un promotor que requiere  
en los insectos existen trasportadores de ARN de doble hebra de la presencia de un antibiótico para inducir la expresión  
(moléculas que permiten tomar el ARN del medio extracelular del ARNsh. Los vectores de expresión plasmídicos son intro-  
e introducirlo en la célula). En el caso del nematodo C. elegans ducidos a las células mediante sistemas basados en lípidos  
se alimenta al gusano con bacterias que produzcan el ARN de o poliaminas o bien por electroporación.  
doble hebra. Otra estrategia es la de microinyectar a la célula,  
Los vectores de expresión virales son vehículos efectivos  
sin embargo, esta técnica es muy especializada (requiere el para la expresión estable de los ARNsh por su posibilidad de  
uso de una aguja extremadamente delgada para inyectar el integrarse al genoma de la célula blanco (15,16). Cuan-  
ARN de doble hebra en el citoplasma celular).  
do estos vectores son empaquetados dentro de pseudo-  
En los vertebrados la técnica, comúnmente, más utiliza- partículas virales, es posible introducirlos prácticamente  
da es la transfección de células que consiste en introducir a cualquier tipo de célula mediante infección. Dos tipos de  
material genético en el interior de una célula eucariota. La vectores han sido desarrollados: los vectores derivados de  
lipofección significa transfección utilizando lípidos. En el oncorretrovirus o retrovirales desarrollados a partir del virus  
mercado existe una gran cantidad de lípidos que se utilizan Moloney de la leucemia murina (Moloney murine leucemia  
para introducir ADN o ARN. Los ARNsi pueden ser transfecta- virus, MMLV) o bien a partir del virus de células madre muri-  
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nas (murine stem cell virus, MSCV); y los vectores lentivira- purinas son más efectivos que sus análogos no modificados  
les desarrollados a partir del virus de la inmunodeficiencia en la protección contra el virus de la hepatitis B, in vivo (20).  
humana-1 (human immunodeficiency virus-1, HIV-1), que Los ARNsh han demostrado inducir la respuesta del interfe-  
también pertenecen a la familia de los retrovirus. Una di- rón mediante la activación del sistema inmune innato y pue-  
ferencia importante entre ellos radica en que los vectores den inducir citocinas proinflamatorias. Se han identificado  
retrovirales sólo infectan células dividiéndose activamente modificaciones químicas que impiden que el ARNsi induzca  
por mitosis, a diferencia de los vectores lentivirales que son esta respuesta inmune. La adición de 2’-O-metilpurinas en  
capaces de infectar células con y sin actividad mitótica (17,18). la hebra sentido de un ARNsh dúplex elimina la activación de  
Existen varias compañías que ofrecen sistemas retro y los TLRs (21) y previene la activación del IFN.  
lentivirales (Clontech, www.clontech.com; Invitrogen, www.  
Sin embargo, se debe prestar especial atención al dise-  
invitrogen.com; System Biosciences SBI, www.systembio. ñar estos ARNsh modificados químicamente, ya que ciertas  
com, etc.). La información necesaria para desarrollar dichos modificaciones pueden inhibir al ARNsh de integrarse ade-